western印跡的步驟
互聯網上幾乎可以搜集到所有WesternBlot的中英文資料，僅供實驗參考，可以根據自己實驗的實際情況進行調整。 這裏提供壹種：
1）按廠商的使用指南用兩塊幹凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配制分離膠液體並脫氣，然後加入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表7.1 聚丙烯酰胺分離膠的配制
試劑成分 配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，壹般地，5%的凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用於16～70kDa，15%用於12～45kDa。
3）用壹根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中壹條墊片的邊緣加入於玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另壹根巴斯德吸管，先從壹邊的墊片，再從另壹邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入壹層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合後，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有壹清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5)傾去頂層的異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸幹。
6)按表7.2配制積層膠液體，用吸管將液體沿壹條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表7.2 聚丙烯酰胺積層膠的配制
GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沈澱物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量標準混合物。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很復雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中只有壹種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復雜程度在小於20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配制：
成 分 體積 (ml)
0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子後，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，並以此緩沖液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。
11）將固定於上槽的凝膠板放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl註射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成壹薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13)再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14）連接電源，對於0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15）關閉電源並撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。連同上槽壹起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在壹疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出壹半，並以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的壹角切去壹小塊以便在染色及幹膠後仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
19)轉膜
將凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時）要放於4℃。英文
1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
20)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動。（這步忘了！）
21)、封閉
1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
22)、壹抗孵育
壹抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，(或4℃過夜)搖床搖動。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
23)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。
24)、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25)、清洗
同22，之後，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因為它可以阻礙底物的沈積。
26)、顯色
按如下配方配制顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A(之後混勻)+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，壹旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。