什麽是Meselson Radding重組模型？
汪亞平 朱作言
The Principle and Strategy of Gene Targeting
WANG Ya-Ping ZHU Zuo-Yan
(Institute of Hydrobiology,The Chinese Academy of Sciences,Wuhan430072)
基因靶位操作(gene targeting)是80年代發展起來的壹項重要分子生物學技術, 是通過外源DNA與染色體DNA間的同源重組，定點修飾、改造基因組特定位點的技術。
1 同源重組
同源重組是基因靶位操作技術的分子生物學基礎。DNA同源重組在基因轉化和遺傳多樣性發生中具有重要作用，受到了眾多研究者的重視。從60年代開始，在真菌系統中對同源重組機制進行了系統研究〔1〕，相繼提出了多個同源重組模型。
1.1 Holliday 模型〔2〕
Holliday等60年代提出的模型是第壹個被普遍接受的同源重組模型，該模型以雜合DNA鏈的形成和隨後的DNA修復解釋真菌中的基因轉化現象，從而建立了同源DNA順序間遺傳信息交換的基本概念。Holliday模型中的基本要素，如Holliday結構和交叉平移等對以後的許多同源重組模型產生重要影響。Potter等〔3〕對DNA重組的電鏡觀察結果，為該模型的Holliday結構提供了直接證據。
1.2 Meselson-Radding 模型〔4〕
Meselson和Radding 在Holliday模型的基礎上作了壹些改進，認為DNA單鏈的形成及其向相鄰DNA雙鏈的侵入為非對稱產生，提出Meselson-Radding 模型。DNA單鏈形成可在壹條DNA雙鏈中首先產生，隨著缺刻處DNA鏈的修復合成，遊離出的單鏈末端侵入相鄰DNA雙鏈中，與同源部分配對結合，被替換的DNA鏈形成壹個逐漸增大的D-loop。D-loop斷開後產生的單鏈末端交叉侵入相鄰DNA雙鏈中，DNA自由末端***價連接形成Holliday結構。Meselson-Radding模型首次將DNA合成與重組聯系起來，這種DNA雜合鏈形成機制似乎更貼切地解釋了非對稱重組現象〔1〕。
1.3 雙鏈斷裂修復模型
在酵母系統的重組研究中，發現載體DNA雙鏈斷裂可大大提高同源重組的效率，Holliday和Meselson-Radding模型都不能很好地解釋這壹現象。基於這壹發現，Szostak 等提出了雙鏈斷裂修復(DSBR)模型〔5〕。在這壹模型中，重組發生在DNA雙鏈斷裂區，斷裂區的修復以對應的同源DNA鏈為模板，修復的斷裂區實質上成為轉化區域。DNA末端***價連接，形成兩個Holliday結構，每壹結構都有兩種解決方式，或形成交換雙鏈，或形成非交換雙鏈。基因轉化不需要DNA雜合鏈的形成和以後的改錯修復過程。DSBR模型與Meselson-Radding模型還有另壹個重要區別，前者的雙鏈斷裂區是信息接受區域，後者的DNA斷裂區是遺傳信息的提供者。
1.4 單鏈退火模型
1984年，Lin等提出完全不同的單鏈退火(SSA)模型〔6〕。在SSA模型中，重組在DNA雙鏈斷裂處開始，在單鏈特異性核酸外切酶的作用下，斷裂點兩側逐漸形成DNA單鏈區域，這壹過程持續到兩個斷點處出現互補DNA單鏈。互補DNA單鏈退火，非互補末端被切除，單鏈缺口修復連接，完成DNA重組。SSA模型沒有其它模型所需的雙鏈DNA的識別配對過程，不形成Holliday結構作為重組的中間過渡形式。因此，重組毫不例外地產生DNA雙鏈交換，並丟失非退火區域單鏈DNA順序。該模型提供了理解同源重組機制的全新視角。
除上述模型外，不同研究者提出了壹引起其它重組模型。Rao等的研究發現，在RecA蛋白的參與下，單鏈DNA分子進入DNA雙螺旋主溝，在同源區域形成穩定的三鏈結構〔7〕。其它研究小組也發現過類似的三鏈DNA結構，認為DNA分子的三鏈結構可能在同源序列識別和重組中起重要作用〔8〕。
同源重組除可在DNA分子間進行外，還可在RNA分子間或RNA與DNA分子間進行。Stuhlmann等研究發現，逆轉錄病毒RNA在逆轉錄中發生高頻同源重組〔9〕，這壹現象在其它RNA病毒中也被證實〔10, 11〕。Derr等在酵母S. cerevisiae中的研究進壹步發現，RNA分子可通過cDNA途徑介導基因組DNA同源重組，提出RNA介導重組模型(RNA-mediated recombination)〔12〕。RNA分子間及RNA介導的同源重組可能提供基因組變異的新途徑。
2 基因靶位操作
70年代後期和80年代中期，以酵母S. cerevisiae 為模式系統，建立了基因靶位操作技術的基礎〔13〕。基因靶位操作技術的建立依賴於幾個重要方面的突破：外源DNA導入酵母細胞方法的建立；有效選擇標記基因(如LEU2和URA3基因)的開發利用和同源重組轉化子篩選系統的建立；靶位載體同源序列DNA雙鏈斷裂提高同源重組效率現象的發現。模式研究確立了基因靶位操作的重要技術參數，並逐漸形成成熟的研究策略。
2.1 插入型載體和置換型載體
基因靶位操作載體有兩種類型，即插入型載體和置換型載體，區別在於載體DNA同源序列雙鏈斷裂位點的位置不同。插入型載體的斷裂位點在同源目的順序內，選擇基因可在載體的任何位置，載體與染色體靶位點進行壹次交換完成同源重組，其結果是整個載體整合到染色體靶位點上（圖1, A）；置換型載體的斷裂位點在同源目的順序的兩側或外側，選擇基因在同源目的順序內，載體同源目的順序與染色體靶位進行兩次交換完成同源重組，重組的結果是由載體的同源目的順序取代染色體靶位順序（圖1, B）。
圖1 基因精細突變策略(A.進退策略;B.標記交換策略)
關於兩種不同載體類型的同源重組效率，有研究發現插入型載體有更高的重組效率，其重組機制接近於雙鏈斷裂修復重組模型，而置換型載體的重組機制尚不清楚〔14〕。Deng等對鼠ES細胞的Hprt位點的22個不同載體序列進行了同源重組效率比較，發現兩類基因靶位操作載體並不存在重組效率上的差異〔15〕。
2.2 基因剔除和基因精細突變
用傳統的遺傳學方法和體外生物化學方法研究基因表達調控和產物生理功能受到諸多因素的限制，基因靶位操作技術的出現，使體外突變的基因導入生物體基因組成為可能，可在細胞和生物體水平上研究基因的表達調控及其生理功能。應用基因靶位操作技術定點改造基因組特定基因主要采用兩種方式：基因剔除和基因精細突變。
2.2.1 基因剔除 基因剔除是在體外進行目的基因的功能缺失突變，突變基因通過基因靶位操作方法導入染色體基因組中，剔除內源野生型基因，實現染色體靶位基因的功能缺失突變。基因剔除主要采用兩種方案：其壹，在克隆的目的基因的5'端和3'端形成兩個突變，每壹突變將獨立產生基因功能喪失，通過插入型載體，將突變目的基因導入染色體基因組中。這壹方法要求在目的基因兩端產生有效突變，特別是3'端的有效突變有較高的技術難度，突變基因產物往往保留部分功能活性，因此，基因靶位操作前要對突變的有效性進行檢測。目的突變基因和染色體靶位基因，串聯的同源基因順序可能二度重組，產生恢復突變。由於上述原因，這類基因剔除方案現已多不采用〔16〕。其二，將選擇標記基因直接插入載體目的基因中，這壹過程通常伴隨目的基因順序的部分丟失，從而產生插入和丟失突變。載體導入靶細胞前在目的突變基因順序兩側斷開，以置換型載體方式將突變基因導入染色體基因組中。與插入型方案比較，置換型載體方案目的基因體外突變方便，由於突變程度加劇，基因靶位操作前不需要突變的有效性檢驗，基因靶位操作轉化子不易產生恢復突變。
2.2.2 基因精細突變 基因剔除方法使基因組中特定基因產生功能缺失，是研究某壹基因的基本功能、了解基因在細胞和胚胎發育過程中作用的有效方法。然而，基因結構與基因功能之間存在復雜的結構功能聯系。如人類遺傳病發生的基礎多是核苷酸水平上的突變，基因剔除方法尚不能很好地研究基因精細結構方面的變化。另外，基因剔除方法還存在壹些潛在的不利因素，如滯留在基因組中的正向選擇標記基因不僅會造成所在染色體區域較大範圍的中斷，而且它攜帶的啟動子或 增強子也可能會使鄰近基因的轉錄失調，產生難以預料的表型〔17〕。在基因剔除方法的基礎上，發展了多種改進策略，以滿足基因精細結構研究的需要。
(1)進退策略: 進退策略由Hasty和Valancius首先提出，它包括兩次同源重組過程。第壹次以插入型載體同源重組到基因組靶位點中，完成目的突變基因和標記基因的導入，在選擇培養基中得到轉化細胞克隆。第二次同源重組在基因組中的目的突變基因和染色體靶位基因之間自發產生，其結果是載體骨架、標記基因和壹個同源基因順序環出，基因組中可能保留導入的目的突變基因，這壹自發性同源重組過程稱之為回復。回復的頻率視不同染色體靶位點而有所差異〔17〕。回復轉化子在相應選擇培養基中篩選克隆。用PCR或Southern雜交方法可檢測回復轉化子是否包含目的突變基因(圖1, A)。Hasty等應用進退策略，在鼠ES細胞同源異型基因族Hox-2.6基因3'端引入壹個翻譯終止碼，得到短截43個氨基酸的突變蛋白〔17〕。Valancius等采用類似的方法，在鼠ES細胞Hprt-中插入了壹個4堿基的插入突變〔18〕。
(2)標記交換策略: 1993年，Askew等提出壹個新的基因組定點突變策略〔19〕，即標記交換策略。它包括兩個過程，首先，用置換型載體將選擇標記基因導入基因組靶位點，在相應的選擇培養基中篩選轉化子細胞克隆。第二步將目的突變基因順序以置換型載體導入靶細胞中，在選擇培養基中得到同源重組轉化子，實現染色體靶位基因的定點突變，同時剔除靶位基因中原先插入的選擇標記基因（圖1, B）。
Askew等采用標記交換策略，在鼠ES細胞基因組非選擇性基因α2異構Na, K-ATP酶基因中引入兩個密碼子突變和3個無表型突變〔19〕。標記交換策略中，第壹步選擇基因的標記和第二步目的突變基因置換具有相對獨立性，被標記的細胞系可與多種目的突變基因進行交換，因此，應用此策略可建立染色體靶位基因的多種遺傳缺陷動物模型，在基因結構與功能研究中具有重要意義。
(3)Cre-loxP重組系統策略〔20〕: Gu等提出的Cre-loxP重組系統策略是進行基因組定點突變的新途徑。Cre-loxP重組系統包括Cre重組酶和loxP位點兩個部分，Cre重組酶由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，loxP位點是Cre酶作用的特異性重組位點，由兩個13-bp的反向重復順序和8-bp間隔區域構成。Cre重組酶可切除同向重復的兩個loxP位點之間的DNA片段和壹個loxP位點，保留壹個loxP位點〔21〕。Cre-loxP重組系統可在哺乳類細胞和轉基因鼠中介導loxP位點特異性重組〔22, 23, 24〕。Gu等進壹步提出由同源重組和位點特異性重組組成的兩步重組策略，第壹步，通過置換型載體進行同源重組，向基因組靶位點引入選擇標記基因，並在其兩側引入兩個同向排列的loxP位點。第二步，通過Cre重組酶介導的loxP位點特異性重組，切除位於兩個loxP位點之間的所有順序，而位於其外側的結構順序則均被保留。這壹策略可通過位於兩個位點之間或之外的結構順序的不同設計，達到對靶位基因不同的修飾結果。Gu等在鼠ES細胞中首次應用該策略，定點缺失突變了免疫球蛋白重鏈基因中的JH～Eμ順序，並通過胚胎細胞嵌合體技術，得到該基因突變型小鼠。Cre-loxP重組系統除介導特異性缺失功能外，還具有介導定點整合的重要特性。已有研究證實，Cre-loxP重組系統可介導外源DNA向病毒載體中的定點整合〔25〕。應用Cre-loxP重組系統可以精確預定DNA缺失的片段長度，並可使之在很大範圍內變化。在表達Cre重組酶的胚胎細胞中，幾乎所有的loxP位點間的順序被切除〔26〕。另外，與其它策略相比，轉化的ES細胞經歷的篩選時間較短，對ES細胞的胚胎重建能力影響較小〔20〕。基於上述特點，這壹策略在研究基因順式調控元件方面具有重要意義。
2.3 哺乳類細胞中的基因靶位操作
基因靶位操作技術應用於哺乳類細胞經歷了兩個時期。早期的研究著眼於外源標記基因的同源重組，最初的研究中，將兩個具不同缺失突變的neo基因***轉染細胞，兩個不同缺限型neo 基因同源重組，形成壹個野生型neo基因和壹個雙重突變的neo基因，並隨機整合到細胞基因組中，產生G418抗性細胞克隆。進壹步的研究發現，使其中的壹個轉化載體線性化可大大提高G418抗性細胞克隆數目，這和在酵母基因靶位操作中看到的情形壹致。這些研究結果顯示，外源DNA在哺乳類細胞中能進行高效率的同源重組〔16〕。為進壹步研究外源DNA順序與染色體DNA順序間的同源重組效率，將缺陷型標記基因以隨機重組的方式整合到細胞染色體基因組中，如neo和HSV-tk等基因，建立基因組中可選擇的標記基因靶位。在上述轉化細胞中導入該標記基因的另壹類型突變順序，在相應的選擇培養基中篩選重組子克隆。研究證實，導入細胞內的外源DNA順序可與內源靶位DNA順序進行同源重組，但同源重組率極低，大約在10-5～10-6之間。
另壹類模型研究則以哺乳類細胞內源可選擇標記基因作為定點突變的靶位。Hprt基因是壹個理想的內源標記基因，Hprt基因與X染色體連鎖，在雄性胚胎來源的ES細胞中以單拷貝存在，因此，只需要單壹拷貝基因突變即可獲得可選擇性表型。Hprt+細胞和Hprt-細胞可分別在HAT培養基和6-TG培養基中篩選。Doetschman等應用基因靶位操作技術，成功地修復了小鼠Hprt- 突變型ES細胞，在HAT培養基中獲得Hprt+細胞，並證實野生型突變由基因同源重組所至，同源重組效率為1.4×10-6[〔30〕。由於Hprt基因突變表型可以直接篩選，該基因被用於多種基因靶位操作模型研究〔31, 32〕。
哺乳類細胞基因靶位操作面臨兩大困難〔33〕。壹方面，哺乳類細胞基因組龐大(109bp以上)，比酵母復雜得多，加之哺乳類細胞培養技術上的限制，哺乳類細胞中基因靶位操作成功率極低；另壹方面，哺乳類細胞似乎有極強的隨機整合外來DNA片段的能力，同源重組與非同源重組的比率大約為10-3～10-4 〔29, 30, 31, 34, 35〕。因此，建立高效可行的基因靶位操作轉化子篩選系統，是哺乳類細胞基因靶位操作的重要前提和技術保障。
作者單位：中國科學院水生生物研究所,武漢430072
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