馬鈴薯原生質體如何制備、分離純化？
1. B5培養基上萌發擬南芥種子，待根長至1-3厘米時即可移栽到土裏，溫室培養，光照12h/12h，150μE。
2. 準備好壹個90mm培養皿，稱1.82克D－甘露醇於20ml雙蒸水中。培養皿的蓋子用來切葉片。
3. 取4周後未抽臺前的葉片，約90片。切成1mm寬的長條，置於甘露醇溶液中。可以壹邊切壹邊從植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解體系。
5. 將步驟3中細條撈出，置於酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小時。
6. 酶解液過100-200目的篩子，將過濾後的綠色混合物置於15ml離心管（直徑約1cm）中，均分為兩管。4℃，60 g，15min，brake 設為4-5。
7. 棄上清，沈澱用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 設為4-5。
8. 棄上清，沈澱用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管4ml。冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 設為4-5。棄上清，每管沈澱用0.5ml MaMg重懸。（本步驟及以下操作均在23℃。）
10. 取約10-20ug 質粒於1.5ml EP管中，加100ul 步驟9中的原生質體。用200ul 槍頭（剪去前端）輕柔混勻。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，輕柔混勻。放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，來回顛倒混勻。23℃，100 g，1min，brake 設為4-5。
13. 棄上清，加100ul W5，混勻。加900ul W5，混勻。
14. 上述混合液體置於六孔板內，23℃，弱光，孵育6-18小時。
15. 熒光觀察，觀察之前100g，常溫，離心2分鐘，終體積控制在50ul左右。
Solution Recipes
Enzyme solution
1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)
1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)
1.09 g mannitol
1ml 0.3M KCl
1ml 0.3M MES, pH 5.7
Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding
1ml 0.15M CaCl2
1ml 0.75mM β-mercaptoethanol
1ml 1.5% BSA
PEG solution (40%, v/v)
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!
0.75 ml H2O
0.625 ml 0.8 M mannitol
0.25 ml 1M CaCl2
W 5
1000 ml
154 mM NaCl 9.0 g
125 mM CaCl2 18.4 g
5 mM KCl 0.37 g
5 mM glucose 0.9 g
0.03% MES 0.3 g
pH to 5.8 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 bottles
MaMg solution
100 ml
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2
0.1% MES 0.1 g
0.4 M mannitol 7.3 g
pH to 5.6 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 ml bottles
References
1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. ics.mgh.harvard.edu/sheenweb/