科研PCR引物設計原則

1、引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。擴增產物的單鏈不能形成二級結構。1引物應具有特異性。

2、③引物內部不應出現互補序列。④兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3′端的互補重疊。

3、PCR引物設計的11條黃金法則引物最好在模板cDNA的保守區內設計。DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。

4、引物設計原則長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]壹般不大於38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。

5、PCR引物設計的目的是找到壹對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。

6、引物設計有3條基本原則：引物與模板的序列要緊密互補。引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。