庫爾特原理的庫爾特原理發展的歷程
華萊士·H. 庫爾特和他的兄弟小約瑟夫·R. 庫爾特提出了壹種使細胞通過壹個感測小孔的簡單想法以來，此行業的發展經歷了三個階段 。
在第壹個階段，華萊士希望將常規的紅血球計數工作變為自動操作的願望，促成了上述簡單想法的提出、庫爾特原理的定義、此原理的專利獲得、其被美國國立衛生研究院認可、以及在壹次美國國家級研討會上對此原理進行了闡述。
在第二個階段，庫爾特兄弟專註於商業化儀器的實用化，並專註於通過經營公司來支持此儀器的生產和銷售。
在第三個階段，針對感測孔功能特性引發的體積測定錯誤，進行了廣泛的研究；庫爾特兄弟不斷成長的公司找到了各種解決方案，從而開發了自動化越來越高的血液分析儀。 通過在其它地方獲得了技術經驗後，華萊士於1946年回到了芝加哥，此後他邀請了其兄弟小約瑟夫·R. 庫爾特加入他的研究。
他後來回憶了他們在壹個地下室實驗室中的工作：“最開始的方法是對向下經過毛細管、通過壹條光束的血細胞計數，就像統計正走下走廊的人們的人數壹樣。但我們沒有獲得非常好的感測信號，我們問自己這是為什麽。除了調節光束的方法外，是否有其它方法由細胞的通過動作產生電脈沖信號？”盡管當時我們不知道答案，但血細胞是絕緣體 – 因此我們通過調節電流而不是調節光束，而獲得了解決方案。 通過壹項本質上簡單的解決方案，華萊士在1947年已經將毛細管的長度降到了最低。
“在我們開始時，我們沒有多少錢，我們在煙盒上取下的壹張玻璃紙上，用加熱的針刺了壹個小孔。雖然這種小孔維持不了多久，但我們對壹些細胞進行了計數。”刺有小孔的玻璃紙通過橡膠圈固定覆蓋在玻璃管的末端之上，並將連接在電源上的兩個電極分開，懸浮在離子介質中的細胞和電流儀器流過刺有小孔的玻璃紙。壹個細胞在此小孔中的液體排水量（等於其自身體積），與傳導電流流經此小孔的兩個電極之間的電壓脈沖成正比。
庫爾特兄弟發現，細胞和懸浮介質之間的電反差，是通過光電方法獲得的電反差的10倍，通過所產生的電壓脈沖可非常容易地對流經小孔的懸浮液中的細胞進行準確計數。這項發現促使華萊士不惜花了非常長的時間來尋找壹位願意代辦專利權申請的律師。最後在1948年，有人介紹了Irving Silverman給他，後者認可了此項具有重大潛力的新方法。1949年，提交了專利權申請。
但專利權審查人員也懷疑是否可對壹個孔能授予專利。幸運的是，他猜想如果可以提供壹些應用例子（而不僅僅提供“通過小孔的軸向電流和感測通道”這壹原理），在對狹小電流通道中的粒子進行感測的原則基礎上，可以獲得專利。1 對橫穿小孔中懸浮液流的模擬通道進行了描述，還描述了具有非圓形橫截面的小孔。壹根絕緣的針搜尋穩定懸浮液中經過的粒子是另外壹個例子；壹個粒子的存在，是通過移動的針和接觸導電懸浮介質的另壹個電極之間電流中的脈沖來感測的。因此這樣定義了新的庫爾特原理，在50年前的1953年10月20日，授予了具有開創性的專利權，在試管的內壁較低處形成的極微小孔為專利首先的實例。
同時，庫爾特兄弟繼續進行研發，重點在於使自動化變得可行。在Walte Hogg（約瑟夫在服役時的朋友）的無償幫助下，庫爾特兄弟組裝了壹臺實驗性儀器（與海軍研究局簽訂的合同項目）：壹個機械測量系統驅動受控制的壹定量的細胞懸浮液流過小孔，同時壹個連接器件向其提供電流，並通過具有可調閥值的電壓放大器感測所產生的信號脈沖。超過閥值的信號脈沖會觸發安裝在連接器件頂部的脈壹個沖計數器（Berkeley科學模型410；貝克曼儀器公司，[當時]在加州裏士滿）。通過連續增加閥值，對樣本重復進行測試，可人工記錄細胞大小的累積分布。由於需要監測小孔是否部分組塞，因此加裝了壹臺示波鏡，可以同時監測信號脈沖和閥值的設定。
1956年華萊士其個人技術論文中正式宣布了庫爾特原理。7 “在新的計數器中，讓單個細胞穿過懸浮液中壹個小的狹窄電流通路，然後檢測細胞和懸浮液各自導電性的差別。壹個小的狹窄電流通路和光學系統中的壹小束光線類似。在通過液體中小的電流路徑時，單個血細胞改變了電路中的電阻，使得穿過電流通路後電壓的下降發生了變化。小規模的電流通路和流過通路的含有細胞的液體流都具有簡單的結構。電流通路的邊界就是壹個絕緣容器內壁上尺寸很小的潛孔口。” 在圖3中，該潛孔口即是帶孔圓片A上中心孔。
此後不久，出版了兩份美國國立衛生研究院的評估報告。8,9 兩份報告都認為庫爾特方法在給紅細胞計數時提高了準確性、有效性和方便性。刊出其中壹份評估報告的期刊同時也做了新的庫爾特計數器?的第壹份廣告。另壹份評估報告9 認為粒度分布上的偏斜度是細胞重合造成的，並提供了壹種糾正重合造成的計數損失的人工方法。它還包含了白細胞計數的初步數據。
自動進行重要血液測試工作的可行性已經得到證明，但商業化運作還未展開。牢固地固定小孔的工作還很困難。10 壓力計（用來測量通過小孔後懸浮物）中使用的水銀也是需要顧慮的事情，實驗性計數器中的機械系統就顯得尤為重要 。用來為小孔提供激勵電流的電壓源對小孔以及用來懸浮細胞的介質的特征，都會產生無法接受的靈敏度。在美國國立衛生研究院開展的研究中，已經確認需要自動稀釋計來精確地稀釋樣品。 約瑟夫總結準備工作時說，“我們知道還有很多問題，但是我們已經知道了壹些有用的東西。”下壹個十年就要開始了，很快在新申請的專利中都會有這些問題的解決方法。 庫爾特計數器的核心是感測小孔（見圖3，圓片A上的小孔），它這時得到了庫爾特兄弟最多的關註。對於許多潛在的應用來說，要求小孔直徑小於100 lm，允許的尺寸和形狀容差都很小。樣品試管壁上直接做成的小孔可重復性低， 這樣就促使對玻璃帶孔圓片（形成毛細管的橫截面）進行實驗。但是用來固定圓片的接合劑沒有成功（無效），且如果將下孔焊接在樣品試管上，熱量會使得小孔扭曲變形。還試用了用作表軸承的環寶石，Hermann Foery（瑞士珠寶公司，位於瑞士洛迦諾市）提供了實驗用的寶石，用其做成了早期低噪聲小孔。與Sam Gutilla（美國伊利諾斯州芝加哥市Del Mar Scientific公司）合作，開發出壹種將寶石焊接到樣品試管上的方法。寶石上精確的柱狀小孔不受焊接的影響，並為電流的流動和樣品懸浮液提供了持久耐用的管道。
到1958年底，對焊接有環寶石的可互換樣品試管（見圖3中的B）的提出了專利申請。10 所選寶石的厚度可以提供小孔長度直徑比約為0.75，這樣可以盡量減少基本專利4和美國國立衛生研究院研究9中提到的微粒重合現象。到了1958年，庫爾特兄弟已經準備好創立庫爾特電子公司，以及庫爾特銷售公司。母公司最早的兩名全職員工是長期提供義務服務的小約瑟夫 R.庫爾特和沃爾特·豪格（Walter Hogg）。庫爾特兄弟的父親最初只是周末到公司來做兼職的秘書和會計工作，但此時他已經68歲了，他從鐵路報務員的崗位上退休，和他的兒子們壹起工作，壹直到1971年才部分退休。沃爾特是第壹個在公司工作達20年之久的員工，指定其為發明人的美國專利比指定華萊士為發明人的美國專利還多壹些（各為95項專利和82項專利），沃爾特也是公司內唯壹比華萊士擁有更多專利的員工。
事後看來，1958年是壹個重要的起點。Kilby發明了振蕩器——第壹個集成電路。很快地，Noyce和Hoerni開發出平面工藝，使得微電子迅猛發展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光學頻率上工作的要求，在兩年後，Maiman發現了激光。所有這些發展都為新公司的未來起到了舉足輕重的作用。
開始時由Ernie Yasaka組裝原型的復制品14，也就是現在所說的A型庫爾特計數器?，由華萊士進行銷售。為了可用於工業目的15 ，在樣品臺上添加了壹個攪拌器（見圖4）。新公司立即需要關註的是壹篇論文證實脈沖幅度和顆粒體積之間有正相關關系。通過將壹個庫爾特計數器?和具有雙可變脈沖閾值的單通道脈沖－高度分析器（PHA）進行連接，Kubitschek獲得了第壹個微分粒度分布；這樣就凸顯出A型計數器的兩個缺點：第壹，它單壹的閾值需要通過連續增加閾值進行多次樣品測試來獲得累積粒度分布14,16，而且需要大量的時間和計算來人工獲得微分粒度分布。很明顯，非常需要自動化方法進行粒度分析；第二個缺點是，用於提供小孔電流的電壓源使得脈沖幅度對於特定小孔的大小、特定懸浮介質的電阻系數以及特定懸浮介質中溫度引起的變化都很敏感14,15，這些都使精確計數和粒度分析變得復雜。
圖4 A型庫爾特計數器，帶工業用途樣品臺（圖3），右邊所示。樣品臺右上側的黑色圓形物體為攪拌器馬達，用於使工業用途粒子保持在懸浮液中；在血細胞計數時，樣品架上不會使用攪拌器。控制臺從左到右包括：機械計數器（用於慢速累計的高值數字），三個十進制計數器（用於快速累計的低值數字），以及示波鏡顯示管。單閥值和小孔電流的控制裝置在顯示管治下。
在白細胞計數上取得了良好的成果後17，公司在1960年引進了壹種改進的儀器18 ，旨在進壹步對細胞和顆粒大小進行精確的測量。使用電流源對小孔進行激勵代替了原來的電壓源，而用來感測顆粒脈沖的雙閾值電流靈敏放大器代替了原來的單閾值電壓放大器。因此，B型庫爾特計數器對限制A型計數器的那些因素不敏感，它的雙閾值聯鎖，形成了壹種可移動的通道，由定序四秒計時器來控制。它附屬的H型分布繪圖儀20可以從100秒樣品運行中自動累計25個通道的微分粒度分布18。C型庫爾特計數器的開發也取得了進展——它的原型包括12通道的脈沖－高度分析器。它的350多個真空管可以給公司的設施供暖，它的體形巨大，搬運時需要拆開。到1961年，當公司從芝加哥搬到佛羅裏達州的Hialeah時，C型庫爾特計數器已經小到可以放在桌面上了。
20世紀60年代，在紅細胞和白細胞7,18,22–28的計數和大小測量上，A型和B型計數器都證明很有用（見評論25,27），而且在微生物學和工業領域粒度分析上也獲得了應用31 。但同時，也產生了擔憂。1959年，按照庫爾特原則設計了壹種商用型儀器。32 1960年，美國國立衛生研究院研究中9所發現的非對稱分布得到了證實。笨重的稀釋器促使壹位客戶自己設計更好用的儀器22。1962年，發現感測小孔的長度直徑比影響粒度分析的分辨率。34 壹家公司（後來成為庫爾特兄弟公司的競爭對手）就庫爾特原則的壹種衍生模式35申請了專利，而庫爾特銷售公司的壹名主管自己也申請了壹種衍生樣品管的專利36，他後來離開了庫爾特公司，也成為了庫爾特公司的競爭對手37。此外，早期的血小板計數實驗也遇到了沒有預想到的幹擾，幹擾顯然來自相位顯微鏡無法發現的小顆粒38。
Lushbaugh等人將100通道的PHA和A型庫爾特計數器39,40連接在壹起，提高了測量的成本。很快，幾家公司都把為特定目的制作的庫爾特顆粒感測器和商用型PHA連接在壹起，可以提供多達512個通道29。體積測量工具的可用性和復雜度越來越高，使得在測量各種細胞和顆粒的粒度分布上，使用人工工具越來越明顯1。華萊士這樣評論說，“面臨挑戰也很好，我們肯定能夠分享壹部分好處。” 感測小孔（見圖3帶孔圓片上的小孔）是庫爾特原理的核心，設計壹個庫爾特計數器，自動彌補其功能特點上的不足，成為首要任務。美國國立衛生研究院的研究註意到，感測小孔的敏感量是幾何小孔的三倍，這是激勵電流流過樣品容器和樣品管中懸浮介質所產生的電場的結果（見圖3）。量測系統產生的類似水動力場使得細胞（或粒子）通過感測小孔時，細胞（或顆粒）和電場產生相互作用。對於兩種小孔場來說，重要的顆粒相互作用是發生在包含感測小孔的敏感體積內，而且從小孔入口和出口處成半橢圓形向外延伸到三到四倍小孔直徑的距離處。
因此，通過排出和細胞相同體積量的導電懸浮媒介，每個細胞在它的範圍內扭曲了電場——特別是在通過感測小孔時。結果是，細胞的體積和小孔的相當。小孔電阻的變化（通常是50,000分之壹），以及通過小孔時帶來的電阻的細小變化，產生了信號脈沖，這樣就能夠進行細胞計數和測量大小。要達到精確的計數和可重復的大小量測，要求通過小孔的懸浮流非常平穩。 和離子電流不同，由於懸浮介質的聚集和黏性，懸浮液流受到感測小孔表面慣性和邊界層的影響。結果是，這些對小孔和它的兩個孔口產生微幾何學反應50 ，在小孔軸心中點周圍產生不對稱的動力流場。在出口孔洞產生的環型流體將顆粒帶回小孔的感測體積內，這樣會產生二次脈沖，導致錯誤的顆粒計數結果。例如，沃爾特·豪格在壹次早期的血小板研究中發現38，所遇見的假微粒是那些重新進入感測體積內的紅細胞，二次脈沖使它們重新被計作血小板。將顆粒從出口孔帶走的輔助流可以防止顆粒循環和二次脈沖。
壹直認為同時通過小孔敏感體積的細胞通過屏蔽顆粒脈沖會減少細胞計數4,7，但計數上的損失可以通過懸浮液中細胞濃度從統計學角度預測出來9,52–60。因此，單通道計數可以通過合適的電路自動糾正61，最新壹個版本的D型庫爾特計數器介紹了這壹方法。然而，同時通過的顆粒產生的非典型脈沖還導致了粒度分布變寬45，典型紅細胞粒度分布出現不對稱39–41,44,62。在美國國立衛生研究院的研究中9把這種不對稱歸為粒子重合，但很快在其它細胞類型38和粒子的粒度分布中也發現了這種不對稱31,63,64。在提高測定體積的準確性後，紅細胞的粒度分布被證實呈雙峰性40,41,65。這些分布假象都造成尺寸測量的分辨率降低。 到20世紀60年代後期，與體積測定產生假象的原因有關的研究迅速發展28,30,44,45,49,65–78，幾個研究單位根據庫爾特原理建立起實驗系統。顆粒以離軸不同的徑向距離通過感測小孔時，會出現麻煩的粒度分布假象。在低有效顆粒濃度下，長度是直徑幾倍的小孔可以提高測量分辨率34,41,67,80，圍繞壹個更小懸浮液流的輔助流可以水動力方式將通過小孔的顆粒集中在軸附近。在典型的顆粒濃度下，在小孔中心點對信號脈沖抽樣，或者按照持續時間對信號脈沖進行選擇，可以大大提高體積測定的精確度（見概覽65,67,78,86–88）。 對小孔功能特性進行研究的壹個重要結果就是發明了第壹個細胞分類器48,70,89–91，它可以判斷紅細胞雙峰分布是事實還是假象。Fulwyler將庫爾特原理和噴墨技術相結合，並使用該成果將細胞從單壹的分布模式中挑選出來。當挑選出來的紅細胞被重新測定大小後，結果表明原來的雙峰形式是壹種假象。 在這次研究大發展中，庫爾特計數器的型號隨著電子學的發展而發展，裝有晶體管的F型和C型同時替代了A型。樣品臺進行了改裝，J型分布繪圖儀代替了H型分布繪圖儀。1968年下半年，出現了第壹個自動化的血液分析計94——7個參數的S型庫爾特計數器?。同時，裝有晶體管的T型庫爾特計數器?代替了C型庫爾特計數器?，用於工業目的。在集成電路的基礎上，1970年推出了Z系列計數器。1972年出現了Channelyzer?體積分析儀，同時還出現了工業用TA系列分析儀，它包含了計數器和16通道PHA電路。隨後不久，這些儀器都開始采用微處理器。
華萊士經常評論說1，“只要它是有用的，人們就會購買。”隨著產品的不斷改進，銷售量也越來越大。 2000年以後出品的Multisizer系列在工業、生物等各領域具有不可替代的地位，源自於該型號具備極高的分辨率，並可依據其最新開發的DPP處理器，單獨分析個體顆粒的脈沖信號，使得對測量全過程顆粒或細胞的體積或粒徑的變化的監控成為可能。該脈沖處理器的技術的誕生也使得粒度分析儀領域添加了壹項獨壹無二的過程監控功能（圖五）。
圖五：Multisizer 3 型 庫爾特計數及粒度分析儀當前廣泛應用於各個行業。
庫爾特原理的軸向實施模式迄今已經獲得了廣泛的關註，但是由於熱噪聲的原因，使得將其尺寸縮小的努力遇到了瓶頸。原則上來說，第二種形式采用橫穿懸浮流的激勵和感測，這樣可以感測到更小的顆粒，但代價是要求體積線性化（基於選定形狀的小孔和電極）。 庫爾特原理第四階段的發展是包括以上所說的這些，還是將新出現的科學技術和已有的技術相結合，我們拭目以待。
壹個人能有壹位良師是幸運的。而那些有幸和庫爾特兄弟壹起工作的人擁有了兩位良師。這篇簡短的回顧文章是為了紀念傑出的兄弟倆，他們總是喜歡努力做得更好，也鼓勵自己做得更好。