總黃酮分離純化工藝大孔樹脂法純化松花粉總黃酮的工藝研究
關鍵詞：松花粉；黃酮；大孔吸附樹脂；純化
松花粉為松科植物馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）、油松（Pinus tabuli formis Carr.）或同屬數種植物的幹燥花粉。具有收斂止血、燥濕斂瘡的功效，用於外傷出血，濕疹，黃水瘡，皮膚糜爛，膿水淋漓。松花粉中含有黃酮類、多糖、膽堿、脂肪酸類、蛋白質、微量元素等多種成分，國內外臨床驗證松花粉具有抗疲勞、降血糖、抗衰老、抑制前列腺增生、護肝、調節免疫功能、減肥、美容等多種藥理作用,被譽為“花粉之王”。本課題將對松花粉中黃酮類化合物的純化工藝進行了深入系統地研究，以期為進壹步研究松花粉的進壹步開發利用提供參考性依據。
1 實驗材料
1.1儀器
FA1004N分析天平（上海第二分析儀器廠）；UV765紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；RE-52旋轉蒸發儀（山海安亭實驗儀器有限公司）；層析柱 2cm×50cm （錦州市友晟化玻經銷處）；D101型大孔樹脂(天津農藥廠生產) ；AB- 8 、X-5 ( 天津南開大學化工廠生產)
1.2試藥
松花粉（購於陜西省藥材市場，經生藥教研室雷國蓮教授鑒定為松科植物馬尾松的花粉）； 蘆丁對照品（購於中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。
2 總黃酮的含量測定方法
2.1總黃酮含量的測量：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法。蘆丁標準液濃度 Y(mg/mL)與吸光度 X 的關系為：Y=4.1164X-0.0368（R2=0.0998）。
2.2黃酮上樣液的準備：取松花粉700g，加10倍量60%的乙醇提取2次，每次1.5h。提取液過濾、減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，以水稀釋至5000 ml，作為供試液。（總黃酮含量為0.497mg/ml）
3 純化工藝的研究
3.1大孔樹脂的預處理
將層析柱清洗幹凈，以防其他物質對樹脂的汙染，排凈柱內水分，於層析柱內加入95%乙醇，將新樹脂投入柱中，浸泡24h，用95%乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，直至流出液1ml加4ml蒸餾水不呈白色混濁為止，然後用蒸餾水以同樣流速洗至無醇味；用2BV5%HCl以6BV/h流速通過樹脂層，並浸泡4h，後用蒸餾水以同樣流速洗至出水PH中性，用2BV2%NaOH以6BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡4h，後用蒸餾水以同樣流速洗至出水PH中性。
3.2樹脂的篩選
3.2.1不同大孔樹脂對松花粉總黃酮的靜態吸附量實驗
精密稱取處理好的三種樹脂各 1g，置於 50mL 具塞磨口三角瓶中，加入精密量取的供試液 20mL，振蕩器上持續振搖 12h，使充分吸附，取上層液 1mL 測定總黃酮含量，結果見表1。
3.3不同吸附樹脂對松花粉總黃酮靜態洗脫性能考察實驗樹脂靜態洗脫
利用上壹步靜態飽和吸附總黃酮後的樹脂，濾出吸幹表面水分，精密加入 80%乙醇，振蕩器上振搖 12h，測定總黃酮含量，結果見表2。
由表1、表2可以看出，無論是飽和吸附量還是洗脫率， D-101均表現出了最佳性能，故選擇D-101型大孔吸附樹脂對松花粉總黃酮進行純化實驗。
3.5 D101 型大孔樹脂的純化工藝。
3.5.1上樣流速
取處理過的 D101 型樹脂 3g，濕法裝柱，將 4 份供試液（總黃酮濃度為0.497mg·mL-1）20mL 分別以 0.5mL·min-1、1.0mL·min-1、1.5mL·min-1、2.0mL·min-1的流速通過樹脂柱吸附，測定吸附率，結果見表3。
由表3可以看出，上樣的流速控制為1.0～1.5mL·min-1為佳。
3.5.2上樣濃度
取供試液3份各 20mL 加入樹脂柱內，控制流速為 1mL·min-1，收集流出液，在 500nm 處測定吸光度，計算吸附率，結果見表4。
由表4可以看出，樹脂對3份樣液的吸附率與濃度有關，濃度越大，吸附率越高。
3.5.4 pH 值
取供試液 20mL，用 1mol·L-1HCl 調節 pH 值為 3、4、5、6、7，控制流速 1mL·min-1進行吸附，用 50%的乙醇以 1mL·min-1的流速洗脫，收集洗脫液，於 500nm 處測定吸光度計算總黃酮含量，結果見表5。
由表5可知，上樣液PH值調至5.0-6.0為佳。
3.5.5上樣量
取供試液加入樹脂柱內，控制流速 1mL·min-1進行吸附，每1BV體積流出液為壹份，500nm 處測定並計算總黃酮含量，繪制D101 大孔樹脂的泄漏曲線。見圖1。
由圖1可知，當樣品流出液體積為6BV時，大孔樹脂接近飽和狀態。此時，樹脂與原藥材比約為1:3。
3.5.5洗脫劑濃度
分別移取供試液 20mL（總黃酮濃度為 0.497mg·mL-1），以 1mL·min-1的流速進行動態吸附後，先用6BV 水以 1mL·min-1的流速洗脫，再依次用 10%、30%、50%、70%.90%的乙醇5BV 以 1mL·min-1的流速梯度洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮含量，並計算黃酮的解吸附率，結果見表6。
由表6可以看出，50%乙醇的解吸附效果最好。
2.3.6洗脫速度
取4份供試液各 20mL 以 1mL·min-1的流速進行吸附，用 50%的乙醇洗脫，流速分別為 0.5mL·min-1、1.0mL·min-1.1.5mL·min-1、2.0mL·min-1，收集洗脫液，於 500nm處測定吸光度，計算總黃酮含量，結果見表7。
由表7可知，洗脫速度以0.5～1.0mL·min-1為佳。
3.5.7純化後松花粉總黃酮純度測定
從表 8 可以看出，使用大孔樹脂純化松花粉總黃酮後，純度可以達 80%以上，而且重現性良好。
4 結論
研究結果表明，D101型大孔吸附樹脂對松花粉黃酮的純化相對較好，具有較高的吸附率和解析率；采用 D101 大孔吸附樹脂對松花粉黃酮純化的工藝研究過程中，研究了多個因素對上樣效果和洗脫效果的影響。最終得到的工藝是：上樣液濃度 0.358 mg/mL，上樣液流速1 mL/min，用50%乙醇溶液以 1 mL/min 的速度洗脫3BV，松花粉總黃酮純度可達80%以上。
參考文獻
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作者簡介：
彭修娟（1981-），女，山東臨沂人，研究生，講師，研究方向：中藥藥效物質基礎研究。