蛋白質質譜分析具體流程
王海龍楊靜祁振國嶽秀蘭
(包頭醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古包頭014010；赤峰市第壹醫院’)
中圖分類號(}so3 文獻標識碼A 文章編號1006—740X(2006)02—0231壹o3
蛋白質組學是後基因組時代的壹個新領域，它通
過在蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的整體蛋白
質的定量研究，來揭示生命的過程和解釋基因表達控
制的機理? 。蛋白質組學分為表達蛋白質組學(Ex·
pression Proteomies)和細胞圖譜蛋白質組學(Cell Map
Pmteomies)，前者指細胞和組織表達的蛋白質的定量
圖譜，它依賴二維凝膠電泳圖譜和圖像分析，它能在整
體蛋白質水平上研究細胞的通路，以及疾病、藥物和其
它生物刺激所引起的紊亂，因此它可能發現疾病標誌
和闡明生物通路；後者是指通過純化細胞器或蛋白質
復合物，用質譜鑒定蛋白質組分，確定蛋白質和蛋白質
相互作用的亞細胞位置 。9O年代以來隨著人類基
因組計劃的實施，引發了生物信息學(Bioinformaties)
的發展，使蛋白質分析發生了革命性的變化。現在將
高分辨2壹維電泳、高靈敏度的生物質譜和快速增長
的蛋白質和DNA數據庫三者結合起來，為高通量的蛋
白質組學(High throughout Proteomies)鋪平了道路 。
這裏主要介紹質譜技術在蛋白質組學中的應用。
收稿日期：2006-03-02
作者簡介：王海龍(1951壹)，男。大學，副教授。
l 質譜技術的發展歷史
1．1 質譜的開發歷史要追溯到2O世紀初，Thomson
創制的拋物線質譜裝置，1919年Aston制成了第壹臺
速度聚焦型質譜儀，成為了質譜發展史上的裏程碑。
最初的質譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，
隨著離子光學理論的發展，質譜儀不斷改進，其應用範
圍也在不斷擴大，到2O世紀5O年代後期已廣泛地應
用於無機化合物和有機化合物的測定。現今質譜分析
的足跡已遍布各個學科的技術領域，在固體物理、冶
金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學、生物化學及
生命科學等領域均有著廣闊的應用。質譜技術在生命
科學領域的應用更為質譜的發展註入了新的活力，形
成了獨特的生物質譜技術。
1．2 基本原理質譜(Mass Spectrometry)是帶電原
子、分子或分子碎片按質量的大小順序排列的圖像。
質譜儀是壹類能使物質離化成離子並通過適當的電
場、磁場將它們按空間位置、時間先後或者軌道穩定與
否實現質量比分離，並檢測強度後進行物質分析的儀
器。質譜儀主要由分析系統、電學系統和真空系統組
成 。
用於分析的樣品分子在離子源中離化成具有不同
質量的單電荷分子和碎片離子，這些單電荷離子在加
1 J 1 J 1"J 1掩J
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維普資訊
232 包頭醫學院學報 第22卷
速電場中獲得相同動能並形成壹束離子，進入由電場
和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過
電場後偏轉大，速度快的偏轉小；在磁場中離子發生角
速度矢量相反的偏轉，即速度慢的離子依然偏轉大，速
度快的偏轉小；當兩個場的偏轉作用彼此補償時，它們
的軌道便相交於壹點。與此同時，在磁場中還能發生
質量的分離，這樣就使具有同壹質量比而速度不同的
離子聚焦在同壹點上，不同質量比的離子聚焦在不同
的點上，其焦面接近於平面，在此處用檢測系統進行檢
測即可得到不同質量比的譜線，即質譜。通過質譜分
析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中
同位素構成和分子結構等多方面的信息 J。
2 質譜技術種類
2．1 電噴霧質譜技術(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛細管的出口處施加壹
高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化
成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強
度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶壹個或多個電荷
的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進
入氣相? 。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子
而不是碎片離子，使質量電荷比降低到多數質量分析
儀器都可以檢測的範圍，因而大大擴展了分子量的分
析範圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電
荷數算出。電噴霧質譜的優勢就是它可以方便地與多
種分離技術聯合使用 j。
2．2 基質輔助激光解吸附質譜技術(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是將
分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用激光照射
晶體時由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量
蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分
析物膨脹並進入氣相。MALDI所產生的質譜圖多為
單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的
質量有壹壹對應關系。MALDI產生的離子常用飛行
時間檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足
夠，檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的，因此質
譜很合適對蛋白質、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轟擊質譜技術(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 壹種軟電離技術，是用快
速隋性原子射擊存在於底物中的樣品，使樣品離子濺
出進入分析器，這種軟電離技術適於極性強、熱不穩定
的化合物的分析，特別適於多肽和蛋白質的分析研究。
FABMS只能提供有關離子的精確質量，從而可以確定
樣品的元素組成和分子式。而FABMS—MS串聯技術
的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息，從而
使其在生物醫學分析中迅速發展起來 ]。
2．4 同位素質譜技術是壹種開發和應用比較早的
技術，被廣泛地應用於各個領域，但它在醫學領域的應
用只是近近幾年的事。由於某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，該化合物又易於用同位素標示，人們就
想到用同位素質譜的方法檢測其代謝物中同位素的含
量以達到檢測該病原菌的目的，同時也為同位素質譜
在醫學領域的應用開辟了壹條思路。
3 電泳分離後凝膠上蛋白質的質譜鑒定
電泳分離後凝膠上的蛋白質，先用適當的蛋白內
切酶酶切成肽段，再用質譜鑒定。現有四種制樣方法：
3．1 凝膠內酶切凝膠內酶切的靈敏度高，是當前廣
泛采用的樣品制備方法。最常用的蛋白內切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白質主鏈精氨酸和賴氨酸的C壹端進行
切割。文獻中有多種凝膠內酶切的方法，這裏介紹改
進後的Wilm的方法。
將電泳後凝膠上的蛋白質斑點以最小的體積切
下，並將凝膠塊切成約lmm 小顆粒，轉入小離心管
內，加入約5O 的lOOmmol／L碳酸氫銨溶液洗膠粒
5min，棄去碳酸氫銨液，加入50pJ乙腈使凝膠脫水1O
壹15min。若膠粒未完全脫水再用乙腈脫水～次，棄去
乙腈液。將離心管置入真空離心蒸發濃縮器內，微加
熱15rain使膠粒完全幹燥。將50pJ新鮮配制的
10mmoVL DTY韻100mmol／L碳酸氫銨溶液加入離心
管內，使膠粒水化。在56℃加熱30rain還原樣品，棄
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加熱幹燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的
100mmol／L碳酸氫銨溶液，烷基化半胱氨酸殘基上的
巰基。室溫暗室中放置20 min，棄去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac內幹燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使膠粒再水化，
加入1O壹2o 碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37cI=保溫1小
時後，放置過夜，所得溶液供質譜分析用。
3．2 電洗脫後在溶液中酶解 電洗脫是電泳後從凝
膠上回收蛋白質的經典方法。通常蛋白質量多於0．
O01 mmol。將含SDS的凝膠與MALDI TOF MS分析結
合，可分析亞mmol的蛋白質。Schuh macher等用無
SDS pH2．5的乙酸銨作洗脫緩沖液，電洗脫系統的極
性相反，蛋白質SDS復合物在原位解離，遊離的蛋白
質遷移至陰極，用標準蛋白樣品實驗，回收率達25％
～ 56％ [引
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用於質譜分
析，因為它的靈敏度低於凝膠內酶切。電轉移時不是
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第2期 王海龍，等．質譜技術在蛋白質組學中的應用 233
所有的蛋白質都能有效轉移，而且在印跡過程中蛋白
質可能丟失。另外從PVDF膜上提取酶切後多肽時效
率不高，提取時加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去汙劑幹擾質譜鑒定 J。
3．4 印跡過程中酶切 1999年Bins等報道將固定有
胰蛋白酶的膜，置於凝膠和PVDF膜之間在印跡過程
中使蛋白質樣品發生酶切，為了蛋白質完全酶切，印跡
過程需要特殊設計。印跡後的膜用基體溶液浸透後可
用MALDI TOF MS直接分析。該法的主要特點是印跡
過程中平行進行酶切，其靈敏度不如標準方法 J。
4 用肽質量指紋譜鑒定蛋白質
蛋白質組學中最有意義的突破是用生物質譜鑒定
電泳後凝膠上的蛋白質。質譜技術已取代了生物化學
中經典的Edman降解技術¨。。，這是由於質譜技術能
進行高通量的分析，能分析蛋白質混合物，而且靈敏。
肽質量指紋譜方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成為高通量蛋白質鑒定的選用方法。分析
時用MALDI TOF MS測定凝膠內酶切後多肽混合物的
質量，獲得肽質量指紋圖譜。蛋白質酶切後生成多肽
混合物，可以在蛋白質序列數據庫內進行理論預測，並
對質譜實測多肽混合物與理論預測的數據進行比較，
質譜實測到足夠肽段的質量與數據庫中壹個蛋白質理
論預測肽段質量匹配，蛋白質可明確鑒定_1 。
隨著科學技術的進步，質譜也得到了快速發展，特
別是與生物技術的結合，開創了質譜應用的新領域。
質譜已成為生命科學研究中非常重要的工具。其研究
成果也將大大推動人類基因組的研究，並將使人類對
生命的本質，其發生發展過程的認識達到壹個前所未
有新高度。
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