如何利用雜交瘤技術制備單克隆抗體
2013-04-27 11:29
1、動物免疫
(1) 抗原制備
制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。壹般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇
根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以壹般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤壹般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定
免疫是單抗制備過程中的重要環節之壹，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有壹個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下註射、腹腔或靜脈註射，也采用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後壹次加強免疫多采用腹腔或靜脈註射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後壹次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後壹次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，壹般免疫3天後即可融合。
2、細胞融合
（1） 主要試劑的配制
a、 細胞培養基 雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配制方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。
不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml
100×L.G.溶液1ml
雙抗溶液1ml
7.5% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g
超純水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
雙抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml
用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml
小牛血清15-20ml
用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。
HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml
HT貯存液1ml
HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml
HT貯存液1ml
A貯存液1ml
b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。
d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。
g、 HEPES溶液（1 mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100 ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5 ml/瓶），4℃保存。
h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200 mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4 mol/L NaOH 1 ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99 ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20 ug/ml）。
i、 50% PEG: 稱取PEG 1 000 或4 000 20-50 g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6 ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調pH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。
⑵ 髓瘤細胞的準備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復蘇後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5 ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的壹瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、 於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（壹般按壹塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100 ml培養瓶培養的細胞進行準備）。
b、 融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50 ml離心管或融合管內。
c、 1000 r/min離心5-10分鐘，棄去上清。
d、 加入30 ml不完全培養基，同法離心洗滌壹次。然後將細胞重懸浮於10 ml不完全培養基，混勻。
e、 取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%臺盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1 ml加入0.9 ml臺盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2
⑶ 脾淋巴細胞的準備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鐘，於解剖臺板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另壹盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml註射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用註射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，制成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加臺酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。
⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，壹般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用註射器註射10ml不完全培養基至腹腔，註意避免穿入腸管。右手固定註射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨後吸出註入的培養液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養基將沈澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每只小鼠可得3-5×106個細胞，因此壹只小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上壹層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。
⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這裏介紹的是作者所在實驗室常用的壹種。
A、 將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於壹支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。
C、 在手掌上輕擊融合管底，使沈澱細胞松散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、 用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、 用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鐘。
F、 1000r/min 5分鐘；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沈澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、 分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、 經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
3、雜交瘤細胞篩選
雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準備、簡便，便於壹次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。壹般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另壹個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學範圍”，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，壹個陽性/陰性判別系統就夠了。另壹方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學範圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。