診斷試劑基礎知識
1.1 抗原
抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質。抗原進入機體後，可刺激機體產生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大於 5000 的蛋白質。小分子化合物在與大分子蛋白質結合後能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原（ hapten ）。例如某些激素、藥物等。抗原的反應性取決於抗原決定簇（ antigenic determinant ），或稱為表位（ epitope ）。壹個抗原分子可帶有不同的決定簇。
1.2 抗體
1.2.1 抗體的結構
抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig) 。 Ig 分五類，即 IgG 、 IgA 、 IgM 、 IgD 和 IgE 。與免疫測定有關的 Ig 主要為 IgG 和 IgM 。 Ig 由兩個輕鏈（ L ）和兩個重鏈（ H ）的單體組成。 Ig 的輕鏈是相同的，有κ（ kappa ）和λ（ Lambda ）兩種型別。五類 Ig 的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。 IgG 和 IgM 的重鏈分別稱為γ（ gamma ）鏈和μ（ mu ）鏈。
IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段（ Fab ）。每個 Fab 都保存結合抗原的能力，但只有壹個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合後不出現凝集或沈澱。另壹區段稱 Fc 段，無抗體活性，但具有 IgG 特有
的抗原性。
IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個片段，壹個 Fab 雙體，稱 F （ ab' ） 2 ，能和兩個相同的抗原結合；另壹片段類似 Fc ，隨後被分解成小分子多肽，無生物活性。
IgM 是由五個單體組成的五聚體，含 10 個重鏈和 10 個輕鏈，具有 10 個抗原結合價，由於空間位置的影響，只表現為五個抗原結合價。 IgM 分子量約為 900000 ， IgG 分子量約為 150000 。
機體被微生物感染後，先產生 IgM 抗體，然後產生 IgG 抗體。經過壹段時間， IgM 抗體量逐漸減少而消失，而 IgG 抗體可長期存在，在疾病痊愈後可持續數年之久。
IgM 抗體壹般為保護性抗體，具有免疫性。因此 IgM 抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。
1.2.2 抗體的產生
機體受抗原刺激後， B 淋巴細胞產生相應的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清（ antiserum ）。每壹系 B 細胞只產生針對某壹抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原註入機體，則將由多系的 B 細胞產生相應的多種抗體，這些抗體均存在於免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清壹般用抗原免疫兔、羊或馬制得。產生抗體的 B 細胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細胞融合成雜交瘤細胞。將單個雜交瘤細胞分離，在體內或體外培養而分泌的抗體單克隆抗體（ monoclonal antibody ， McAb 或 Mab ）。單克隆抗體僅針對壹種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細胞（含產生抗體的 B 細胞）與小鼠腫瘤細胞融合，分離雜交瘤細胞，接種於小鼠腹腔，產生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。
1.3 抗原抗體反應
1.3.1 可逆性 抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是壹種動態平衡，其反應式為： Ag+Ab → Ag · Ab 。 . 抗體的親和力（ affinity ）是抗原抗體間的固有結合力，可以平衡常數 K 表示： K=[Ag · Ab] ／ [Ag][Ab] 。 Ag · Ab 的解離程度與 K 值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離後的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的 IgG 抗體僅占總 IgG 中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應用於免疫測定中可得到更好的效果。
1.3.2 最適比例 在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復合物（沈澱）的量見圖 1-4 。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的範圍，稱為等價帶（ zone of equivalence ）。在等價帶前後分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沈澱物形成，在免疫測定中稱為帶現象（ zone phenomenon ）。抗體過量稱為前帶（ prezone ），抗原地過量稱為後帶（ postzone ）。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統中有足夠的抗體量，否則測得的量會小於實際含量，甚至出現假陰性。
1.3.3 特異性 抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（ HBsAg ）、 e 抗原（ HBeAg ）和核心抗體（ HBcAg ），雖來源於同壹病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在壹非常復雜的蛋白質化合物（例如血清）中測定某壹特定的物質，而不需先分離待檢物。
但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促性腺激素（ hCG ）和黃體生成激素（ LH ）均由α和β兩個亞單位組成，其結構的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用 hCG 免疫動物所得的抗血清中含有抗α -hCG 和抗β -hCG 兩種抗體，抗α -hCG 抗體將與 LH 發生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗 hCG 抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中 hCG ，只能用於 hCG 濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量 LH 將與之發生交叉反應。因此在作為早孕診斷（敏感度應達到 50mIu/mlhCG ）的實際中必須應用只對 hCG 特異的抗β -hCG ，以避免與其它激素的交叉反應的發生。
1.3.4 敏感性 在測定血清中某壹物質的含量時，化學比色法的敏感度為 mg/ml 水平，酶反應測定法的敏感度約為 5~10 μ g/ml ，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達 ng/ml 水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定 HBsAg ，其敏感度可達 0.1ng/ml 。
1.4 免疫測定在臨床檢驗中的應用
由於各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用範圍極廣，在臨床檢驗中可用於測定：
1) 體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。
2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。
3) 抗生素和藥物。
4) 病原體抗原， HBsAg 、 HBeAg 等。
5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗 -HBs 等。
1.5 ． 標記的免疫測定
如上所述，免疫測定是壹種很敏感的測定方法，抗原抗體反應後直接測定形成的沈澱或濁度，敏感度可達 5~10 μ g/ml ，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低於這壹水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最後用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沈澱物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，壹般加入過量的標記試劑以保證與待測物徹底反應。以標記抗體（ Ab ※）檢測抗原（ Ag ）為例，反應式如下： Ag+ Ab ※ → AgAb ※ + Ab ※。在反應產物中有與 Ag 結合的 Ab ※和遊離和 Ab ※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，遊離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可采用多種手段，固相載體是其中之壹。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然後再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而遊離的標記物留於溶液中。這樣可以通過洗滌將遊離的 Ab ※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。
1.6 ．酶免疫測定
酶免疫測定（ enzyme immunoassay ）可分為均相（ homogenous ）和非均相（ heterogenous ）兩種類型。在均相 EIA 中可不需進行遊離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應後形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映遊離的酶標記物。均相 EIA 在臨床檢驗中較少應用。非均相 EIA 需先進行遊離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作壹種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在 1971 年最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定（ enzyme linked immunosorbent assay ），簡稱 ELISA ，在國內有譯作酶聯免疫吸附試驗或酶標，已習用。