殼聚糖遊離氨基的數目如何確定
本方法適用於紅曲米、紅曲紅、紅曲發酵液和功能性紅曲中桔青黴素的測定。
2 原理
試樣中的桔青黴素經提取、凈化及濃縮後, 根據在高壓液相色譜上的出峰面積測定含量。
3 試劑
3.1 乙腈：HPLC級；
3.2 磷酸：分析純或色譜純；
3.3 甲醇：HPLC級；
3.4 甲苯：分析純；
3.5乙酸乙酯： 分析純；
3.6甲酸：分析純；
3.7水：去離子水
3.8乙醇：色譜純
3.9桔青黴素標準溶液:：準確稱取桔青黴素標準品（美國Sigma公司），用甲醇溶解，制成500 mg/L的儲藏液， 工作液稀釋到100mg/L，置4°C冰箱中備用。
3.10高壓液相色譜洗脫劑：乙腈-去離子水（用色譜純磷酸調pH至2.5）[35+65，v/v]
4 儀器
4.1 高效液相色譜儀；
4.2色譜柱：Eclipse XDB C18反相色譜柱，250 × 4.6mm, 粒度直徑為5μm；
4.3試樣環：20μL；
4.4檢測器：熒光檢測器，λex=331，λem=500；
4.5 VCX 400超聲波細胞破碎儀；
4.6電子天平：千分之壹或萬分之壹；
4.7 pH計：精度為0.01；
4.8勻漿器；
4.9離心機；
4.10旋轉蒸發器；
4.11 分光光度計
4.12 0.45μm的微孔偏氟濾膜；
4.13具塞試管；
4.14燒杯；
4.15比色管。
5 分析步驟
5.1 桔青黴素的提取
5.1.1紅曲米樣品的預處理
準確稱取粉碎的紅曲米粉（細度達到測定色價時的要求）0.5—3.0g(根據紅曲樣品中的桔青黴素含量高低而定) 於50mL燒杯中，加入20mL復合萃取劑甲苯：乙酸乙酯：甲酸（7：3：1，v/v），稱重，記錄下連燒杯在內的重量，超聲波處理10min（強度40%，5s，5s），自然澄清後稱重，如果重量低於原重量，需用復合萃取劑補足。將上清液移入50mL具塞試管中，殘渣中另加入15mL復合萃取劑，第二次稱重並超聲波處理（10min），自然澄清後稱重，用復合萃取劑補足至超聲處理前的重量，上清液移入50mL具塞試管，殘渣用15ml復合萃取劑再重復提取壹次。合並三次提取液，充分混勻後取30ml離心（3000rpm，20 min），上清液真空濃縮至幹後溶於30ml甲醇中，微濾後取20μl 進行HPLC分析。
5.1.2液態發酵液的預處理
用均質器將發酵液中的菌絲打碎，取10mL均勻打碎的發酵液於比色管中，用乙醇定容至25mL，60℃加熱1h（期間不斷振搖），3000rpm離心15min，上清液微濾後取20μl進行HPLC分析。