檢測氯黴素的行業標準
1. 試劑與材料
1.1氯黴素試劑盒，德國r-Biopharm公司
1.2乙酸乙酯，分析純
1.3雙蒸水
2.儀器與設備
2.1微孔板酶標儀，MuLtisKan Ascent,芬蘭Labsystens公司。
2.2 8道移液器，50-300uL
2.3 單道移液器，5-50ul,20-200ml,100-1000ul,1-5ml
2.4 離心機。
2.5 旋轉蒸發器，配真空冷卻系統。
2.6 液體混勻器。
3.樣品前處理
3.1樣品提取 稱取約2g（準確至0.01g）蜂蜜於20ml具塞試管中，加入用4ml雙蒸水溶解，再加4ml乙酸乙酯，在混勻器上混勻10分鐘。將上述樣液轉至10ml離心管中，以4000轉/分離心12分鐘
3.2凈化 從上述離心管中移取1ml上層的乙酸乙酯（相當於0.5樣品）至另壹試管中，60℃以下減壓旋轉蒸幹，殘留物用0.5ml緩沖液1溶液，此為樣品溶液，供酶標儀測定
4.測定
4.1 酶標儀測定條件
酶標儀測定波長為450nm
4.2 酶標測定（以下操作在20-24℃室溫條件下進行）
4.2.1測定之前的準備工作
將氯黴素酶試劑盒附帶的所有試劑回升至室溫20-24℃。其中氯黴素酶標記物、氯黴素抗體用緩沖液1以1；11的比例稀釋，在吸取濃縮液之前，要仔細振搖使之充分混勻
4.2.2 標準應用的制備；50uL標準濃縮液（氯黴素試劑盒附帶）用450uL緩沖液1稀釋並混合均勻用玻璃不能用塑料瓶
標準應用液1：50uL標準濃縮液1用450uL緩沖液1稀釋oppt
標準應用液2：50uL標準濃縮液2用450uL緩沖液1稀釋50ppt
標準應用液3：50uL標準濃縮液3用450uL緩沖液1稀釋150ppt
標準應用液4：50uL標準濃縮液4用450uL緩沖液1稀釋450 ppt
標準應用液5：50uL標準濃縮液5用450uL緩沖液1稀釋1350ppt
標準應用液6：50uL標準濃縮液6用450uL緩沖液1稀釋4050ppt
4.2.3.測定程序：
取出實驗需要數量的微孔板條，按順序加入50ul標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加入50ul稀%@FI
釋了的酶標記物到微孔底部，加入50ul稀釋了的抗體溶液到每壹個微孔中充分混合（輕輕振蕩板並在桌面上做圓周運動以混均）用薄膜覆蓋板上在室溫孵育2小時（註意在加入抗體的過程中移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，避免交叉汙染）
倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（拍打4次）以保證完全除去孔中的液體，用250ul蒸餾水充入孔中（輕輕振蕩板並在桌面上做圓周運動），再次倒掉微孔中液體，重復操作兩遍。註意在洗板過程中加洗滌水的移液器管尖必須置於微孔板上方約1厘米處打出洗滌水。洗板後立即進行下壹步
操作不要讓板孔幹燥。
迅速加入50ul基質及50ul發色劑到每壹個孔中，輕輕振蕩板並在桌面做圓
周運動以混均。室溫孵育微孔板30分鐘，註意暗處避光放置。在恒溫孵育期間準備好反應停止液
加入100ul反應停止液，混勻。立即測量，如果不能立即測量請放置在暗處並於60分鐘內450nm測量OD值
5.試劑空白
以2 ml雙蒸水代替樣品，按上述步驟提取
6結果與計算
6.1繪制標準曲線法
所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第壹個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，因此0標準等於100%，吸光度值的百分比表示。
標準（或樣品）的吸光度值360
×100 ＝ %吸光度
0標準的吸光度值
計算標準的值並繪成壹個以氯黴素濃度（ng/kg）為半對數坐標系統的曲線圖，曲線在50-1350ng/kg(ppt)範圍內應當成為線性。相對應每壹個樣品的濃度（ng/kg）可以從校正曲線上讀出。為了獲得樣品中氯黴素的實際濃度（ng/kg）,從校正曲線上讀出的濃度值必須乘以相對應的稀釋系數。（可采用Labsystens公司提供的MuLtisKan Ascent軟件，從計算機上編制測定程序並進行數據處理，可直接讀取樣品氯黴素的濃度值）。7.方法的檢出限、回收率
7.1本方法氯黴素的檢出限為125ng/kg(ppt)
7.2 回收率: 90%
對蜂蜜樣品進行的回收率實驗,結果如下表示.
樣品本底值(ng/kg)添加值(ng/kg)測定值回收率
蜂蜜