光學顯微鏡最高的分辨率為

光學顯微鏡的分辨率極限約為0.2μm;相隔小於該距離的兩個對象顯示為單個圖像，而不是彼此區分開來。光學顯微鏡的這壹理論限制由兩個因素決定——可見光的波長（λ）和顯微鏡鏡頭的聚光能力（數值孔徑，NA）——根據以下等式：

Resolution=0.61λ/NA

可見光波長為0.4μm到0.7μm，因此對於光學顯微鏡，λ的固定值在0.5μm左右。數值孔徑可以設想為穿過樣品後進入顯微鏡鏡頭的光錐大小。它由等式給出：

NA=η sin α

其中η是光在樣品和透鏡之間傳播介質的折射率。空氣的η值為1.0，但可以通過使用油浸透鏡通過壹滴油觀察樣品，將其增加到大約1.4的最大值。角度α對應於透鏡收集的光錐寬度的壹半。α的最大值為90°，此時sin α=1，因此數值孔徑的最高可能值為1.4。

因此，光學顯微鏡分辨率的理論極限可以計算如下：

Resolution=0.61×0.5/1.4=0.22μm

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