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如何實現快速檢測及有效控制沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是壹種革蘭氏陰性腸桿菌, 也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌。據有關資料統計由沙門氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超過三分之二,2007年發生的“ 花生醬事件”以及 2008 年發生的“ 西紅柿 事件”等[1]沙門氏菌中毒事件的發生也使得食品中沙門氏菌的檢測受到人們的普遍關註。本文主要是對食品中沙門氏菌的傳統檢測方法以及後續建立的以分子生物學、免疫學、生物傳感器和電化學為基礎的快速檢測方法進行了系統的綜述,旨在為該致病菌的檢測方法的研究應用提供壹定的參考。

1、 傳統的檢測方法(國標法)

目前, 我國對食品中沙門氏菌的檢測大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》對食品樣品進行檢測,這種傳統的培養方法可分為前增菌、增菌、分離培養、生化試驗和血清學鑒定等步驟進行。雖然傳統培養法可靠性高,但是其操作繁瑣且耗時費力,並不能滿足食品快速檢測的要求。

2、分子生物學檢測方法

2.1聚合酶鏈反應技術

PCR技術是壹項敏感性高、特異性強且快速準確的微生物檢測技術,也被許多學者用於對食品中沙門氏菌進行檢測和研究。汪琦等[2]就采用傳統培養方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上宋東曉[3]建立了檢測食品中沙門氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用於食品中沙門氏菌的檢測,鐘偉軍[4]通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索,建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法,此研究為食品中沙門氏菌快速檢測試劑盒的研制打下了良好的基礎。

2.2核酸探針技術

核酸探針技術是根據核苷酸堿基互補的原理,在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段,在壹定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強,已用於食品中沙門氏菌的檢測。Almeida等[5]通過建立壹種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測,準確度高達 100%。

2.3基因芯片技術

基因芯片技術是利用已知核酸序列的探針與靶核苷酸序列雜交,然後通過信號檢測對其進行定性與定量分析,在沙門氏菌等各種致病菌的分析檢測中有很好的應用前景。饒寶等[6]通過建立檢測致病菌的基因芯片檢測方法,設計了通用引物和特異性探針: 沙門氏菌探針、大腸桿菌探針和金黃色葡萄球菌探針,實現了同時檢測並區分沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的目的。祝儒剛等[7]運用多重 PCR 結合基因芯片技術建立了檢測肉及肉制品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、誌賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等5種食源性致病菌的快速檢驗方法。

2.4噬菌體裂解技術

噬菌體有特異性裂解細菌的作用。張碧波等學者利用此技術進行沙門氏菌

快速檢測,結果和其他學者相同,據此得出特異性噬菌體可以檢測出沙門氏菌,此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌體裂解對150份食品樣品進行快速檢測,結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高,這對實現沙門氏菌實時、快速而準確的檢測有重要意義。

2.5環介導等溫擴增技術(LAMP)

環介導等溫擴增技術是2000年Notomi等開發的壹種新的恒溫核酸擴增方法,此方法的特點是特異性強、靈敏度高且簡單、快速,適合對大規模樣品的快速檢測[9]。李佳桐[10]通過實驗建立了沙門氏菌的LAMP檢測方法,並將此方法與常規PCR進行比較,結果顯示:LAMP方法對沙門氏菌的檢測恒溫65℃下只需要40min,只擴增沙門氏菌,不會擴增其他革蘭氏陰性菌,最低可檢出濃度10cfu/mL,比常規PCR的最低檢出濃度高1個數量級,通過添加熒光染料SYBR Green Ⅰ,能夠快速簡便的觀察檢測出綠色的陽性結果十分明顯的區別於橙色的陰性結果。

3、免疫學方法

3.1酶聯免疫吸附技術

酶聯免疫吸附法簡稱 ELISA, ,此技術敏感性高 ,不需特殊設備 ,結果觀察簡便,早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用於食品中沙門氏菌的檢測。伍燕華等[11]設計捕獲抗體和檢測抗體,建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。張帥等[12]建立雙抗夾心ELISA體系,檢測模擬汙染肉樣中沙門氏菌,其檢測限為800CFU/g,等均並與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應,特異性良好。

3.2免疫熒光標記技術

免疫熒光標記技術是根據抗原抗體的特異性反應,將熒光素標記在已知抗原(或抗體)上,與特異抗體(或抗原)結合後產生熒光,可用來定位抗原或抗體、並通過定量分析,確定測定含量。葉明強[13]基於納米免疫磁珠富集,免疫量子點標記,建立了壹種食品中沙門氏菌的含量進行快速檢測的方法,研究出了壹種新型的免疫熒光食源性致病菌檢測技術。

3.3斑點免疫金滲濾法

免疫膠體金技術是以膠體金作為標記物結合免疫原理的壹種應用於抗原抗體的新型技術,該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法(DIGFA)。孔繁德等及曹春梅等都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究,曹春梅等[14]是利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌O9抗原進行了研究,結果表明此法簡單、快速,適合推廣運用;孔繁德等[15]是通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。

3.4免疫磁性分離技術

免疫磁珠分離技術是將特定病原體的單抗或多抗與磁珠微球偶聯,並通過抗原抗體反應形成磁珠,在外加磁場作用下磁珠會發生定向移動,從而達到分離目標病原體的作用。食品樣品中致病菌含量很少,常規的方法是很難從中分離出來的,借助免疫磁性分離技術可以達到快速分離的目的。王海明等[16]應用磁免疫技術建立快速檢測食源性沙門氏菌的方法,結果表明此方法能對食品基質中的目標菌進行快速有效的富集,其檢測限<10cfu/25g,檢測周期約為40小時。胡霏[17]也通過實驗針對鼠傷寒沙門氏菌建立免疫磁分離技術結合熒光層析技術的快速檢測方法。

4、生物傳感器技術

生物傳感器是利用壹些生物活性物質如酶 、多酶體系 、抗體等做為敏感器件,然後配以適當的信號傳導器所構成的分析檢測的工具。我國學者已采用此法對沙門氏菌的抗原、抗體的免疫吸附進行檢測,並已用於快速檢測食品中致病的沙門氏菌,而僅需 1h 完成,達到了快速的檢測目的。寧毅[18]在對碳納米管性質研究的基礎上,結合分子探針構建了碳納米管生物傳感器,並將其用於沙門氏菌的檢測,結果顯示所構建的傳感器靈敏度高、特異性強、穩定性好。

5、電阻抗技術

電阻抗法是近年發展起來的壹項生物學技術,因為具有檢測速度快、靈敏度高、準確性好等優點,目前此法已用於食品中沙門氏菌檢測檢驗並已通過美國公職分析化學協會(AOAC)認可。陳廣全等[19]建立了電阻抗法快速檢測食品中沙門氏菌的方法,並將其與常規培養法進行比較,對食品中的沙門氏菌屬進行檢測,結果表明電阻抗法比傳統培養法更加快速、可靠。

6、總結

綜上所述,沙門氏菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進,並向儀器化、標準化、自動化方向發展,並且食品安全、致病菌等問題對人類健康以及生活環境都造成了嚴重威脅,加強沙門氏菌檢測勢在必行。目前沙門氏菌快速檢測技術大多具有檢測迅速、靈敏度高、特異性強等特點,此外這些方法還具有各自的優點和局限性,在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新,建立更成熟可靠、方便快捷的沙門氏菌快速檢測技術。