認識核酸提取的知識筆記2020-05-07
核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。其是：裂解樣品中的核酸遊離在體系；純化遊離的核酸，使之與體系中的其它成分分離（如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離）。
常用的裂解液：包括去汙劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。
去汙劑的作用，是通過使蛋白質變性、破壞膜結構、解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸遊離在裂解體系中。
鹽的作用，除了提供壹個合適的裂解環境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結構的穩定 (如NaCl) 等。
裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便於後面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。
二．最常用的純化方法
（壹） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沈澱：利用PC對裂解體系進行反復抽提以去除蛋白質，實現核酸與蛋白質的分離，再用醇將核酸沈澱下來，實現核酸與鹽的分離。
（二）介質純化：利用某些固項介質，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質及鹽的特點，實現核酸與蛋白質及鹽的分離。
（三）高鹽沈澱去除蛋白質是第壹種純化方法的壹個變體，省略了PC操作的麻煩，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限於簡單的 PCR。
三．裂解方法的評價
（壹）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因組 DNA 的首選。包括裂解遊離的膜蛋白與基因組 DNA 相連接的遊離蛋白質。
（二）不使用蛋白酶的去汙劑裂解方法，在細胞基因組 DNA 抽提方面仍然有優勢。尤其是當得率和純度要求不是最高，而經濟性及操作簡單很重要時，控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關鍵。該方法結合高鹽沈澱，可以實現最簡單的操作，但純度及得率的穩定性可能會比用 PC 抽提的差壹些。
（三）高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首選。
（四）含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。
（五）SDS 堿裂解法是質粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 汙染的特點。
（六）PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的壹類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解後即可直接取裂解液用於 PCR，非常快速。
四．純化方法的評價
（壹）PC 抽提/醇沈澱方法：穩定、可靠、經濟、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質，醇沈澱可以去除鹽，對於壹般的幹凈的樣品 (雜質為蛋白質)，該方法完全可以獲得高質量的核酸。
（二）高鹽沈澱蛋白質/醇沈澱方法：同樣也是壹個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩定性可能要低壹點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是，可以用於大規模抽提，不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。
（三）介質純化方法：是壹個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規模核酸抽提，並且因為受人為操作因素影響小，純度的穩定性很高 (雖然純度不壹定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質可以分為兩大類，壹類是柱式的，即介質被預先裝填在下面是通的柱子裏；另外壹類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。
五．醇的沈澱
醇的沈澱，目的是使核酸從裂解體系中沈澱下來，從而實現核酸與其它雜質（主要是鹽）的分離。實際操作中，許多雜質也會與核酸壹起被醇沈澱下來，尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沈澱並不是非常特異性的，任何有機大分子及壹些鹽，當濃度達到壹定水平後，都可能同步被沈澱下來。最有參考價值的是 TRIzol 提供的壹個沈澱方案：壹半異丙醇加壹半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。
PEG、LiCl、CTAB 都可以用於核酸沈澱。雖然它們遠沒有醇沈澱的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沈澱 RNA 以去除DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沈澱下來。PEG是沈澱病毒顆粒的方便手段。
六．洗滌
洗滌首先壹定要將沈澱懸浮起來；第二就是要有壹定的時間，尤其是當核酸沈澱比較大時 (使核酸沈澱最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。
七．核酸質量的檢測問題
目前用於正式實驗前檢測核酸質量的方法，壹是電泳，二是紫外分光光度儀。
（壹）電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離範圍)，電泳還可以用於估計核酸的濃度，但其準確度與經驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質汙染的信息。
（二）紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，該儀器的靈敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1 為理論上的數據，實際測定時會有壹些差別；但如果差別太大，就有問題了。如： A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280
> 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大許多，壹定是有雜質殘留的。
八．核酸的溶解和保存
純化後的核酸，最後多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程控制得當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。
實驗室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。