嬰幼兒食品中生物素測定微生物法好做嗎

嬰幼兒奶粉中遊離生物素的檢測方法有微生物法、色譜法、熒光法、ELISA法等，微生物法具有靈敏度高的特點，我國國家標準及國際上通常采用微生物法測定。但是由於各實驗室工作條件的差異，嚴格按照國標試驗條件通常無法取得可信的檢測結果，失敗率較高且檢測成本高[1-3]。因此，針對筆者所在實驗室情況對試驗條件進行簡化優化，以期提高試驗質量和檢測結果準確性，降低檢測成本。　1 材料與方法　1.1 試驗材料　供試菌種為植物乳桿菌（ATCC8014），由美國模式培養物集存庫提供。供試培養基為乳酸桿菌肉湯培養基（青島海博），遊離生物素測定培養基（碧迪醫藥器械公司）。生物素標準品（上海安普）。供試儀器與設備：TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析）；LRH-250 生化培養箱（廣東醫療器械廠）；SIK-202凈化工作臺（蘇凈集團安泰公司制造）；YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）。　1.2 試驗方法　1.2.1 標準曲線的制作。樣品處理及標準曲線的制作及樣品測定的步驟參照GB5413.19-2010，接種時使用壹次性無菌註射器垂直懸空滴加1滴菌液。標準曲線工作液濃度c=0.2 ng/mL。　1.2.2 標準曲線溶液配制方式的影響。使用乳桿菌肉湯培養基對菌種進行傳代活化，以第4代菌株制備菌懸液，菌懸液吸光度A=0.57，自標準中間液起分別使用超純水、50%乙醇溶液配制，分別進行標準曲線制作，每種方式重復試驗3次。　1.2.3 菌懸液濃度的影響。使用乳桿菌肉湯培養基對菌種進行傳代活化，使用超純水配制標準曲線工作液，以第4代菌株制備系列濃度菌懸液，菌懸液吸光度（A）分別為0.14、0.22、0.36、0.50、0.64、0.79，分別進行標準曲線制作。　1.2.4 傳代次數的影響。使用乳桿菌肉湯培養基對菌種進行傳代活化，使用超純水配制標準曲線工作液，分別以第1、2、3、4、5、6代菌株制備菌懸液，菌懸液吸光度依次為0.52、0.54、0.56、0.54、0.60、0.55，分別進行標準曲線制作。　2 結果與分析　為考察各因素對標準曲線線性的影響，考慮標準溶液配制方式、傳代培養基選擇、傳代次數及菌懸液濃度對試驗曲線線性的影響。　2.1 標準曲線溶液配制方式的影響　使用50%乙醇溶液配制標準工作液試驗標準曲線基本沒有線性，不能滿足試驗的線性要求，而使用超純水配制標準溶液試驗的標準曲線線性有極大提高，最高可達到0.991 2（表1、表2）， 3次結果均符合試驗要求。GB5413.19中要求使用50%乙醇溶液配制標準工作液，但是由於滅菌過程中的高溫及試管的氣密性問題造成乙醇揮發，導致測試管體積發生不均壹變化導致曲線線性差，同時由於乙醇本身可抑制植物乳桿菌的生長，標準工作液中的乙醇不同程度地影響了試驗最終的微生物生長量也是造成線性差或無線性的原因。采用超純水配制可以避免這些問題的發生，有效提高曲線的線性。　2.2 菌懸液濃度的影響　菌懸液吸光度（A）在0.50～0.79曲線線性符合試驗要求，R2在此範圍內變化不大，菌懸液吸光度達到0.79時雖然線性基本符合試驗要求，但測試管內生長量過大，吸光度過大，對試驗結果有壹定的影響，且試驗時間不宜控制，因此菌懸液吸光度在0.50～0.64較為適宜（圖1）。菌懸液濃度過低，標曲線性差的原因可能是濃度最高管生長終止時間過長，時間過長可能導致植物乳桿菌死亡而無法完全消耗最高濃度管生物素。　2.3 傳代次數的影響　1～5代的菌種均可滿足試驗要求，超過5代以後曲線線性明顯下降，可能原因是隨著傳代次數的增加，菌種發生變異，特異性發生改變，從而無法正常體現植物乳桿菌對生物素的特異性需求，而無法呈線性生長，導致試驗沒有線性或線性差（圖2）。　3 結論與討論　使用超純水配制標準曲線工作液、菌懸液吸光度A=0.57、第4代菌種制備菌懸液來制作標準曲線，曲線y=1.023 7x+0.180 8，R2=0.996 2。對不同樣品進行測定並做加標試驗，平均加標回收率為92%，加標回收率範圍為85%～97%，對同壹樣品進行10次重復試驗，變異系數為3.56%。使用超純水配制標準曲線工作液、菌懸液吸光度A在0.50～0.64、不超過5代的菌種制備菌懸液的條件下，試驗準確度較高，重現性較好，同時采用5個濃度點來制作曲線，較國標方法不僅減輕了工作量而且降低了檢測成本，因此此試驗條件具有壹定的可行性。　試驗過程中器皿的清洗、商品培養基的選擇、菌種使用乳桿菌肉湯培養基傳代活化、標準工作液臨用現配，註射器滴加菌種必須垂直懸空以及培養時間的控制等均是試驗成敗的關鍵。