細胞核移植是移植核呢還是細胞的全部?
實驗技術
壹、蛙的細胞核移植(圖17.1)
(壹)受體卵的準備
1.去膜:
經人工催產使蛙卵成熟。擠出成熟的蛙卵,逐個去掉卵膠膜,接著把卵整齊地排列在高溫滅菌過的培養皿內,使其粘於皿底。並使卵子動物極朝上,以便進行激動和挑核。然後加入適量的手術液,每次可在壹個培養皿內排列卵25-40個。
2. 激動:
蛙卵在未受精前仍處於第二次成熟分裂的中期。為了使卵子完成第二次成熟分裂,排出第二極體,在雙目解剖鏡下,用壹枚消毒過的玻璃針在動物極靠近赤道的地區淺刺壹下,目的是代替自然受精時精子入卵的過程。由於針刺動作比精子入卵的速度快得多,所以針刺手術要輕緩。激動後的卵子,10-15分鐘後產生第二極體。在解剖鏡下可見動物極附近有壹折光的圓形小球,此即第二極體。
3. 挑核:
當第二極體出現時,用壹枚消毒過的玻璃針在極體處斜插入卵子表層,然後迅速提起針尖,由於卵黃膜的破裂,極體下的卵核隨著壹小部分細胞質流出卵外,形成壹個卵外球,壹般極體排出15分鐘以後會逐漸消失。這樣挑核應在極體出先後10分鐘內完成,否則核將沈入卵子中心,去核手術不易成功。
4. 再去膜:
挑核後經過10分鐘左右,待傷口基本愈合時,用兩把磨的很尖的鐘表鑷子,漸次剝去卵外膠膜,直至余下壹層受精膜為止。操作步驟如下:在雙目解剖鏡下,先將壹把尖頭鑷子的壹邊尖端從卵子附著皿底的膠膜處小心而快速地插入到最內層膠膜,然後夾緊膠膜,把卵固定住,再用另壹把鑷子從卵子另壹側夾緊膠膜,向上向後把膠膜掀去,若用兩把鑷子左右對拉,則易損傷卵子,且使卵質變位,影響胚胎發育。
剝膜後的卵子移到盛有手術液的培養皿中置於玻璃板上,供註核用。
(二)供體細胞的分離
取囊胚或早期原腸胚的外胚層作為供體細胞。先在濾紙上除去膠膜,然後移入皿底塗有壹層瓊脂的並盛有分離液的培養皿中,用兩把鑷子剝去胚胎外余下的各層膠膜,切下外胚層,吸去不用的胚胎部分。壹個很小的組織塊放在分離液內數分鐘,並輕輕搖動,細胞便可自行分散。如不分散,可用毛細吸管輕輕吹打。
分散後的胚胎細胞用毛細吸管移到盛有手術液的培養皿中,置於塗有瓊脂的小載玻片上,作為移植時的供體細胞。
(三)核移植
1. 顯微註射器的準備:
每次手術前應向顯微註射器的整個管道系統灌入手術液或雙蒸水,檢查管道的各銜接處有否漏氣。管內只要有壹極小的氣泡,註射器的調節就失靈。同時應註意選擇彈簧上彈性較靈敏的部位以便操作準確(圖17.2,17.3,17.4)。
2. 微型吸管的制備:
吸管最好用軟質玻璃管。制作前,先將玻管用洗液洗凈,再用蒸餾水徹底將酸洗去。這樣可使拉出的微吸管內部潔凈,不致影響細胞核的吸入和射出。將玻管拉成口徑1mm的細管,然後在微火焰上,再拉成微吸管,管徑在10-20微米之間(圖17.5,17.6)。
3. 吸細胞核:
吸核的方法不是將微吸管頭刺入供體細胞內吸取細胞核,而是利用顯微操縱臺通過輕輕地來回轉動千分尺外徑,將壹個細胞慢慢地吸入微吸管。必須註意微吸管的內徑要比細胞小,這樣能使被吸入的細胞由於吸力的作用而破裂,結果可以依靠目測,將細胞核和包在它周圍的壹部分細胞質壹起吸入管內,避免細胞核直接與液體接觸,以免受損。還應調節使供體細胞盡量靠近管口,避免註核時帶入較多的手術液。
4. 註核:
將吸有供體細胞核的微吸管在離動物極45度左右的地方刺入動物半球的中心,再稍微向上提壹下管口,然後輕輕地推動微量註射器,把管內的細胞核連同周圍的細胞質慢慢地註入卵內。如果註射速度太快,註入卵內的壓力過大,則會使卵子破裂,導致實驗失敗。
僅供參考。