western常用試劑
做好Western需要註意各種細節。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開始談起。
1.收樣前3min先配制細胞裂解液（現配現用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻後置於冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自***公司）
2.棄掉舊的培養基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置於冰上，在搖床上裂解30min。
（全程在冰上操作）
1.將動物組織（腦、肺等）取出後分裝成三份或更多（壹份WB，壹份qPCR，壹份備用），取出後立即存於-80℃。（註：取完壹塊組織後立即凍存於-80℃，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）
2.配制細胞裂解液（現配現用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據實際情況調整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好後置於冰上。
3.將其中壹份組織剪下約90mg於有鋼珠的震蕩勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置於-20℃，使用時取出，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度。
4.將勻漿加入90ul現配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。
我采用的是***公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度，和說明書protocol差別不大，稍有不同，如下：
1.稀釋BSA標準品以制作標準曲線：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第壹管加30ulBSA，混勻後再取30ul至第二管，依次倍比稀釋，最後壹管不加為空白（即本底值）。則8個標準品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。
可提前配制：
戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板，清水沖洗幹凈。卡槽對齊卡好後置於軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液。觀察幾分鐘後若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾幹。
1.配制8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M?pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產生。加完後換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當水和膠之間出現壹條水平的折線時，即已凝固。
2.待分離膠凝固後，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放於玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配制4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M?pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿後沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固。可將剩余的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。
3.此時，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和壹小支loading buffer 置於4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均為神經毒性、致癌物質，使用時需小心。
2.灌膠時視線與膠面水平，註意操作，避免膠濺入眼睛中。
3.常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置於37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好，凝固後取下玻板，連夾子、梳子壹同放入蒸餾水中，4℃過夜保存。
1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內槽加滿已配好的1×電轉液，十幾分鐘後觀察是否漏液，若漏液重新調整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒跑完，電轉液就漏完了。
2.輕輕拔去梳子，第壹孔加入5ul預染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入，註意不要將樣品加入其他孔，或加樣過快導致樣品溢出。
3.插好正負極，註意檢查正負極不能插反。調節電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h後；將電壓調至100V（分離膠），約1.5h後，maker分離明顯，在膠底部出現壹條藍色的buffer條帶，此時電泳完畢。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。
註意：避免藍色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經跑出，所以在分離膠底部出現壹條整齊水平的藍色條帶時，即停止電泳。
Little Trick
1.電泳時插好正負極後，從電泳槽底會有小氣泡上升，氣泡的數目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太壹樣，觀察幾分鐘後還是如此，則需檢查是否加錯了電泳液，或者電泳液配制有誤。
2.壹般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環境都有關，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間，並及時觀察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗，結果均壹致。因此，總結出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件。
3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優化，結果可清晰顯出蛋白表達情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關鍵壹步。
4.電泳快結束時即可準備轉膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉液中。建議在第壹次WB後分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數（即樣品數），存好以後隨時使用。
5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，並夾住膜左上角，可最大程度減小對膜上蛋白的損害。
電泳結束後，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開玻璃板，根據maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小壹致的硬紙片。壹般壹塊膠需切下目的蛋白和內參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉液中。
1.根據每壹塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和壹張PVDF膜，浸泡於電轉液中，可以提前準備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經甲醇活化20s後浸泡於電轉液中。
2.在電轉儀上制作“三明治”結構轉移膜，最下面放三層濾紙，然後依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（註意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據膜的總面積調整電流，電轉2h。
3.在電轉的同時，可以配制以下液體，事先根據膜的數量計算好所需體積：
以壹塊膜為例，封閉5ml+稀釋壹抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體，溶於15mlTBST中，漩渦振蕩器混勻，現用現配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，稱取0.75g脫脂奶粉，溶於15ml TBST中，漩渦振蕩器混勻，現用現配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。
Little Trick
1.關於電轉膜，有些使用NC膜。我沒有嘗試過NC膜，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結果仍不理想，換用PVDF膜後有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購買Millipore的PVDF膜，壹卷有些貴，但是可以夠壹個實驗室用好幾年哪。最好不要在經銷商購買分裝的的PVDF膜，另壹實驗室壹同學想著價格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買了100cm2的膜，結果這價格虛高不說，而且膜還是假的，直到做完實驗了才發現，蛋白樣品也浪費了。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。
2.關於電轉方式，有些采用濕轉，有些采用半幹轉，兩種方式均可。個人覺得半幹轉方便簡捷些。
1.電轉結束後，根據maker位置和目的蛋白及內參大小剪膜。可在標有maker的壹邊左上角剪壹個小角，以清楚哪壹條帶是1號樣品。
2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內參，室溫搖床上孵育2h。根據盒子大小，加入封閉液的量需沒過膜。
1.配制p-STAT1壹抗（ 公司），1:500稀釋，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1壹抗，混勻，現配現用。
配制actin壹抗（ 公司），1:2000稀釋，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin壹抗，混勻，現配現用。
2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入壹抗，封口，使膜完全浸泡在壹抗中，放入冰箱，4℃過夜。我壹般用封口膜做成小盒，置於大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加壹抗，完全浸沒，之後和PCR上樣儀壹同固定在搖床上，4℃孵育過夜。
次日，回收壹抗，做好標記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。
1.配制具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現配現用。
2.TBST洗完膜後，加入二抗，室溫搖床上孵育2h。
1.二抗孵育完後，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。
2.壹條目的蛋白即壹張膜需要100ul發光液A和100ul發光液B，根據膜數計算用量，提前4℃混合好發光液A和B。
3.到暗室中加混合好的發光液，在膠片左上角剪壹小角（和PVDF膜壹致），曝光膠片，可分別不同時長曝光，如15s，30s，1min，5min等，然後在顯影液和定影液中顯影，放入自來水中。出暗室後，將膠片掛起晾幹。
也可用Bio-rad凝膠成像系統照相，選擇不同的曝光時間成像。
Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間，多次重復實驗即可采用此曝光時長。我最開始也是在暗室中顯影，後來用Bio-rad凝膠成像系統照相，對比結果發現後者的結果更加清晰明顯，背景也更加幹凈，之後就壹直用成像儀曝光照相了。
2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。
3.膠片左上角maker壹側壹定要剪壹小角或做其它標記，才可在顯影後明顯對應各個樣品。
4.若暗室曝光，可能內參蛋白發光液剛加上就出現很亮的條帶，這時最長曝光15s已經足夠。
若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉等步驟。
1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min。