食品中維生素d 測定
1. 原理
樣品中脂溶性維生素在皂化過程中與脂肪分離，以石油醚萃取後，用正相色譜柱提取富集，用反相色譜柱，紫外檢測器定量測定。
2. 適用範圍
本方法來源於GB/T 5413.9-1997。適用於嬰幼兒配方食品和乳粉維生素A、維生素D、維生素E的測定；也適用於食品或強經食品及飼料中的維生素D含量的測定。
3. 主要儀器
1) 高壓液相色譜儀，具有可變波長的紫外檢測器，數據處理系統或記錄儀。
2) 旋轉蒸發器。
3) 平底燒瓶：250mL。
4) 分液漏鬥：500mL。
4. 試劑
所有試劑，如未註明規格，均指分析純，所實驗用水均指蒸餾水。
1) 異丙醇：色譜純。
2) 2％焦性沒食子酸乙醇溶液：取2g焦性沒食子酸溶液於100mL無水乙醇中。
3) 75％氫氧化鉀溶液：取75g氫氧化鉀溶於100mL水中。
4) 石油醚：沸程30～60℃。
5) 甲醇：色譜純。
6) 正己烷：色譜純。
7) 環己烷:色譜醇。
8) 維生素D標準溶液
A. 維生素D2標準貯備液：含維生素D2100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D2，用甲醇定容於100mL容量瓶中。
B. 維生素D3的標準貯備液：含維生素D3100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D3，用甲醇定容於100mL容量瓶中。
5. 操作步驟
5.1樣品處理：準確稱取10g樣品，於250mL平底燒瓶中，加30mL蒸餾水。
5.2測定液的制備：
1) 於上述樣品溶液中加入100mL的20％沒食子酸乙醇溶液，充分混勻後加50mL75％氫氧化鉀溶液，在蒸汽浴上邊續回流30min後，立刻冷卻到室溫。
2) 將皂化液轉入壹500mL分液漏鬥中，用100mL水分幾次沖平底燒瓶。洗滌液並入分液漏鬥中。
3) 於上述分液漏鬥中，加入100mL石油醚，蓋好瓶塞，倒置分液漏鬥並劇烈振搖1 min.在振搖過程中，註意釋放瓶內壓力。靜置分層，將水相放入另壹500mL分液漏鬥中，重復上棕萃取過程2次，合並醚液到第壹個分液漏鬥中。用蒸餾水洗該醚液至中性，通過無水硫酸鈉過濾幹燥，在40℃和氮氣流下，於旋轉蒸發器上蒸至近於（絕不允許蒸幹）後，用石油醚轉移至10mL容量瓶中，定容。
4) 從上述容量瓶中取7mL放入壹試管中，用氮氣將石油醚吹幹，於試管中加1mL正己烷。
5.3測定：
1) 測定液的制備：
A) 儀器條件：
色譜柱：30cm×40cm，矽膠柱。
流動相：正己烷與環己烷按體積比1：1混合，並按體積分數0.8％加入異丙醇。
流速：1mL/min。
波長：265nm。
柱溫：20℃。
靈敏度：0.005AU/MV。
註射體積：200mL。
B) 註射50mL維生素D標樣和200mL樣品溶液，根據維生素D標樣保留時間收集維生素D於試管中，將試管用氮氣吹幹，準確加入0.2mL甲醇溶解。
2) 測定步驟：
A) 儀器條件：
色譜柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色譜柱。
流動相：甲醇。
流速：1mL/min。
波長：265nm。
柱溫：20℃。
靈敏度：0.005AU/MV。
註射體積：50mL。
B) 註射50mL維生素D標準溶液，註射50mL樣品溶液，得到標樣和樣品溶液中維生素D峰面積或峰高。
6. 計算
ρs×10∕7×40×100
X =
m
As
ρs= ---×ρsd
Asd
式中： X--樣品維生素D的量，mg/100g；
m--稱樣量，含量，IU∕100g；
ρs --進樣液中維生素D有濃度，mg/mL；
A s --進樣液中維生素D有峰高（或峰面積）；
A s d --標樣液中維生素D有峰高（或峰面積）；
ρsd --標樣中維生素D的濃度；
計算結果精確至小數點後壹位。
7. 註意事項
1) 允許誤差及最小檢出量：同壹樣品的2次測定值之差不得超過2次測定平均值的10％；最小檢出量為0.1國標單位。
2) 試劑焦性沒食子酸容易變性，應購習近期生產的試劑。
3) 如果皂化不完全，可適當增加氫氧化鉀的加入量。