炎癥在異種移植中重要作用的證據
越來越多的證據表明豬到非人靈長類動物(NHP)異種移植後存在持續的全身性炎癥狀態(在異種移植受體中稱為全身性炎癥[SIXR])。炎癥標誌物的增加，例如C反應蛋白，組蛋白，血清澱粉樣蛋白A，D-二聚體，細胞因子，趨化因子，以及遊離三碘甲狀腺原氨酸的減少，已經在受體NHPs中被證實。炎癥，凝血和免疫反應之間的復雜相互作用是公認的，但炎癥在異種移植受體中的作用尚不完全清楚。有證據表明炎癥可以促進凝血的激活和適應性免疫反應，但確切的機制尚不清楚。如果要實現延長的異種移植存活時間，可能需要采取抗炎策略(例如，使用抗炎劑，和/或產生保護免受炎癥影響的基因工程器官來源豬)，以防止、控制或否定異種移植受體中發展的全身性炎癥的影響。這可能允許降低外源性免疫抑制治療的強度。如果要獲得異種移植物的免疫耐受，那麽炎癥的控制可能是必不可少的。
器官移植是過去70年來醫學上的成功故事之壹，但是來自已故人類捐贈者的器官仍然不足以治療所有可能受益的患者。例如，在美國，目前大約有12萬名患者在等待壹種或那種的器官，然而今年只有大約1萬名已故的人類捐獻者，平均每個捐贈者提供三到四個器官[1]。
如果有合適的動物器官來源，人體器官的缺乏是可以避免的。由於壹些邏輯和其他原因，豬已被確定為臨床移植器官的潛在來源[2]。因此，在過去的35年中，異種移植(跨物種移植)領域得到了廣泛的研究[3]。雖然移植到人類或非人靈長類動物(NHP)中的野生型(即基因未修飾)豬的器官在幾分鐘內被排斥[4]，我們對豬進行基因工程以保護其器官免受靈長類動物免疫反應的能力已導致維持生命的腎臟或心臟移植物在NHP中存活數月甚至壹年以上[5-9]。必須克服的障礙之壹，但仍然是個問題，是對豬器官存在的炎癥反應。
炎癥是身體組織對有害刺激的復雜生物反應的壹部分，在各種疾病中均可觀察到，如炎癥性疾病[10]，感染[11]，動脈粥樣硬化[12]。適當的促炎細胞因子和趨化因子的釋放對於保護性免疫是必要的，但是這些因子的過度產生會導致各種病理狀態[13]。器官移植後缺血再灌註損傷後出現炎癥反應[14]。這可能在啟動異基因免疫應答[15]和同種移植物血管病的發展[16]中發揮重要作用。
有越來越多的證據表明豬異種移植存在全身炎癥反應(“異種移植受體的全身性炎癥”[SIXR])[17-19]。炎癥促進凝血[17-21]和異種移植後發展的免疫反應[17，18]的激活[22，23]。在器官異種移植的受者中，C-反應蛋白(C-RP)在消耗性凝血疾病或T細胞反應發展之前就會升高[17，18]。浸潤的先天免疫細胞表達組織因子，組織因子在啟動凝血中起作用[24]。炎癥抑制了T細胞耐受的發展[22，25]。
我們在這裏回顧異種移植的長期全身炎癥反應的證據，並考慮可以采取什麽步驟來預防或減少它。我們主要利用了我們自己的觀察結果，但通過對文獻的回顧補充了這些觀察結果。
C-反應蛋白(C-RP)是壹種急性時相蛋白，主要由肝細胞對促炎細胞因子，特別是白細胞介素-6(IL-6)合成[31]。C-RP為侵襲性病原體提供了第壹道防線，並可促進補體激活、細菌包膜腫脹和吞噬[32]。它是早期感染的標誌，並提供了壹個簡單的客觀參數[33]。此外，當存在腎移植急性排斥反應時，C-RP mRNA表達增加[34]。C-RP既能防禦宿主感染，又能增強炎性組織損傷。
在豬到狒狒器官移植後，C-RP在幾個月內增加，表明存在持續的炎癥狀態 13，19，26 ，並沈積在移植的豬腎 18 。這是否是初始抗體結合的次要因素仍然不確定。
血清澱粉樣蛋白A(SAA)是結核病、類風濕性關節炎、克羅恩病和各種癌癥的主要急性時相蛋白和炎癥相關標誌物[35，36]。SAA也是急性同種異體排斥反應的敏感標記物[37]。肝細胞是SAA的主要來源[38]。SAA升高的原因是循環血清白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)增加[39]。由內皮細胞(ECs)、淋巴細胞、特別激活的單核細胞和巨噬細胞產生的炎癥相關細胞因子刺激澱粉樣蛋白A的合成[35，40]。反過來，SAA可能誘導壹些促炎細胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α，IL-1β和趨化因子IL-8[41，42]。然而，SAA也可以誘導趨化因子的分泌，這些趨化因子可能在局部抑制炎癥[43]，並動員磷脂和膽固醇進行細胞修復[44]。
在豬到狒狒器官異種移植後，在抗體介導的排斥期間(圖2)或當消耗性凝血疾病或感染發展時，觀察到SAA顯著增加[26，27]。澱粉樣蛋白A沈積在移植的豬腎中[28]。雖然目前測量SAA的方法不是完全定量的，但它是炎癥狀態的簡單和快速的指示器，允許早期檢查，例如排斥，感染或其他並發癥。
細胞外組蛋白在炎癥中起關鍵作用[45]。在體內，它們導致EC功能障礙(例如，中性粒細胞邊集，出血，血栓形成)，而在體外，它們對EC具有細胞毒性[45]。已鑒定出五種類型的組蛋白[46，47]。組蛋白的釋放可由膿毒癥、創傷、化學毒性、移植損傷和缺血再灌註觸發[48]。它們與各種細胞的Toll樣受體(TLRs)結合，例如血小板、紅細胞[49]，進而誘導NETosis(細胞死亡，顆粒內容物釋放到細胞外，這反過來又增加了組蛋白的釋放並放大了炎癥[50-57]。
組蛋白-DNA復合物的直接血栓前活性增加了炎性細胞因子的形成，並通過激活TLR 2、4和9來促進血栓反應[48]。此外，炎性細胞因子下調血栓調節蛋白，誘導組織因子，並上調纖溶酶原激活物抑制劑[48]。組蛋白也可以引起直接的血小板活化[53，58]。當存在炎癥和凝血功能障礙的證據時，異種移植受體的水平會增加[26]。在沒有IL-6受體阻斷(用tocilizumab)的情況下，豬器官移植後的平均血清組蛋白水平顯著升高 26 。中性粒細胞數量的減少可能會減少細胞外組蛋白的釋放[59，60]。在體外研究中，核因子κB(NF-κB)抑制劑parthenolide(圖3B)顯著減少組蛋白誘導的豬EC雕亡/死亡[26]。EC雕亡在許多炎癥和免疫疾病中被觀察到[61]。
D-二聚體是交聯纖維蛋白降解的蛋白質產物。在血管內凝血和血栓性疾病中觀察到血液中D二聚體濃度升高[62]。D-二聚體可能通過激活中性粒細胞和單核細胞，誘導炎性細胞因子(如IL-6)的分泌而促進炎性級聯反應[62-65]。
D-二聚體也可能是炎癥的標誌[19，64，66，67]，並且當異種移植失敗時可能上升(圖4)[19]。
促炎細胞因子/趨化因子有助於抵抗感染，但可能誘發全身性炎癥[68，69]。在體外研究中，豬IL-6，IL-1β和α激活人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)[70]。豬主動脈內皮細胞(PAECs)可被人IL-6、IL-17、IL-1β和α顯著激活[70]。例如，(I)人IL-17、IL-1β和TNF-α增加粘附分子基因(例如E-選擇素、VCAM-1和ICAM-1)的表達，(Ii)人IL-6、IL-17、IL-1β和TNF-α誘導的趨化因子(例如，IL-8和MCP-1)和組織因子表達增加，以及(Iii)人IL-1β和腫瘤壞死因子-α誘導豬白細胞抗原I類的表達[70]。上述所有的細胞因子/趨化因子都有可能促進異種移植物的炎癥和凝血反應。
在缺乏免疫抑制治療的情況下，在異種移植後可以看到某些細胞因子水平的增加，但在實施免疫抑制治療時不會增加 18 。
炎癥在血小板活化和聚集中起著關鍵作用[71]，這反過來又在異種移植後凝血功能失調中發揮重要作用[72]。細胞外組蛋白與血小板上的TLR，特別是TLR2和TLR4結合，導致血小板聚集[51，53]。在人類中，細胞因子IL-17可以通過ERK2和p53信號通路促進血小板活化和聚集[73，74]，盡管確切的機制尚不清楚[75]。受體血小板也可以通過直接與豬ECs結合來激活[76]。在沒有人血清或抗體的情況下，人血小板在與pAECs接觸後可以上調組織因子的表達，這可以通過凝血酶的產生導致凝血[77]。
低血漿遊離三碘甲狀腺原氨酸(Ft3)與炎癥[78-82]之間存在關系。血漿ft3在腦死亡[83，84]和主要外科手術，特別是體外循環心臟手術後下降[85-89]。
在接受豬心臟、腎臟、肝臟和動脈補片異種移植的受體狒狒中，ft3迅速下降，需要幾天時間才能恢復到移植前的水平 26 。已有報道血清IL-6和腫瘤壞死因子-α與甲狀腺激素濃度呈負相關[80]。持續的低水平幾乎肯定與異種移植物的炎癥反應有關[26]。
直到最近，在NHPs中成功的豬器官移植的壹個主要障礙是凝血酶產生過多引起的凝血功能失調[90-93]。凝血酶受體的激活放大成熟樹突狀細胞產生趨化因子CCL18和肺激活調節趨化因子[94]。凝血酶在體外可上調ICAM-1mRNA並誘導單核細胞表達ICAM-1[95]，並通過激活NF-κB[96]。
眾所周知，炎癥有助於激活凝血功能障礙[17，18，70，97，98]。組織因子不僅是凝血酶的啟動子，也是炎癥的標記物[99，100]。腫瘤壞死因子-α[101]，IL-6[102]和C-RP[103]增加天然免疫細胞上組織因子的表達，從而促進凝血[100，103]的激活。在凝血和炎癥之間存在壹個放大電路，導致炎癥介質以及促凝因子的激活[20]。因此，炎癥的治療預防可能是豬異種器官移植後最大限度地減少凝血失調的主要因素。
最近進行的壹項重要觀察表明，當僅表達天然豬血栓調節蛋白(也具有抗炎作用)的豬血管內皮細胞被腫瘤壞死因子-α激活時，血栓調節蛋白的表達明顯下調(圖7A)[98]。這表明，當豬器官暴露於炎癥(豬器官移植到NHP後是普遍存在的)時，血栓性微血管病可能會發展。缺乏人類血栓調節蛋白的抗炎作用可能導致消耗性凝血疾病的早期發展[6]。相反，人血栓調節蛋白的轉基因表達沒有下調，因此維持了它的抗凝和抗炎作用(圖7b)[98]。
異種移植後某些細胞因子/趨化因子的顯著增加可能是由於先天免疫細胞活性的結果，並且很可能是異種移植損傷的致病因素[17，18]。炎癥和先天免疫反應增強適應性免疫反應70，98。
全身炎癥標誌物的上調與T細胞依賴的適應性免疫反應的無效阻斷有關[105]。
在壹項體外研究中，當豬幹擾素-γ激活pAECs時，人外周血單個核細胞(PBMC)的增殖反應顯著增加，支持炎癥增強異種移植物的免疫反應的概念 106 。移植後T細胞耐受的誘導被炎癥抑制[25]。通過影響免疫反應，細胞因子和趨化因子分泌影響同種異體移植的結果[107，108]。IL-7，IL-8和幹擾素-γ誘導的蛋白10，趨化因子配體9，趨化因子配體2和5的增加與早期同種異體移植物功能障礙相關[109-111]。
炎癥，凝血和免疫反應有著復雜的相互關系[23，50]。例如，凝血酶在體外激活人細胞對豬細胞的反應，並誘導與幹擾素-γ激活程度相同的T細胞增殖反應(圖8B)[97]。
幾種旨在防止或減少異種移植後過度炎癥的策略已經過測試，其中壹些策略已得到臨床批準。
皮質類固醇
皮質類固醇激活幾個基因，包括具有抗炎作用的NF-κB抑制劑[120]。給豬心臟異種移植受體用藥後，IL-6、IL-8和MCP-1水平降低[13]。然而，D-二聚體仍然增加，與皮質類固醇和/或抗炎治療無關，表明炎癥反應持續[13]。
Anti-complement agents
雖然眼鏡蛇毒液因子(CVF)主要用於消耗補體[121]，但MCP-1、IL-8和IL-6在給藥後減少[13]。用豬動脈補片移植的狒狒給予眼鏡蛇蛇毒因子後，IL-6，IL-8和MCP-1仍然低於移植前水平，或與移植前水平相當[13]。Eculizumab是壹種抗C5人源化單克隆抗體，通過阻止C5轉換酶的切割來抑制末端補體效應途徑[122]。它通過增加幹擾素-γ和IL-17，降低IL-4來改變細胞因子的分布。[123-125]。Cp40是壹種由14個氨基酸組成的環肽，它是壹種補體抑制劑，通過抑制C3的激活來抑制促炎效應物(如腫瘤壞死因子-α，IL-1β和IL-17)的產生[126，127]。C1抑制劑是唯壹已知的經典補體途徑絲氨酸蛋白酶C1s和C1r的血漿蛋白抑制劑。它減少壹些促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α，IL-18)和增加保護性細胞因子(IL-10)[128，129]。
IL-6受體阻斷和IL-6抑制劑
用IL-6受體阻斷劑tocilizumab治療豬異種移植物的NHP受體，導致C-RP(圖1A)[19]和血清組蛋白(圖3A)[26]水平大大降低。然而，D-二聚體仍然升高(圖4)[13，19]。阻斷IL-6受體也與異種移植後看到的ft3水平下降的更快恢復相關(圖6)[26]。
tocilizumab對移植物的免疫反應有其他幾種有益的影響。它減少了存儲器B細胞[130，131]和血漿細胞[132]的數量，但增加了調節性B細胞[133]和調節性T細胞[134]的比率。它還減少單核細胞和骨髓樹突狀細胞[135]。接受tocilizumab治療的同種異體腎移植受者遭受較少的抗體介導的排斥[136]，並且降低了供者特異性抗體水平[137]。
然而，最近的證據表明，tocilizumab雖然與靈長類IL-6受體結合，但不與豬移植物上的IL-6受體結合[70]，因此可能對移植物沒有保護作用。IL-6抑制劑siltuximab通過中和IL-6的產生對Castleman病和某些炎癥性疾病具有治療作用[138]。用Siltuximab中和IL-6導致Castleman病的持續C-RP抑制[112]，但在異種移植中並不完全有效[Zhang G，等，手稿制備]。
抗組蛋白抗體
細胞外組蛋白和TLR通路是治療各種炎癥條件的主要靶點。抗組蛋白治療具有預防異種移植中組蛋白誘導的炎癥的潛力[26]。使用抗組蛋白抗體(例如，抗組蛋白H4單克隆抗體)可抑制細胞因子的產生，並對各種炎癥損傷具有保護作用[45，56，139-147]。rTBM對組蛋白毒性的保護作用是通過激活蛋白C依賴性和非依賴性途徑介導的[148]。抗組蛋白抗體尚未在異種移植的體內模型中進行測試。
腫瘤壞死因子-α抑制劑
EC激活被腫瘤壞死因子-α抑制劑減少[113]。在體內異種灌註模型中，TNF-受體融合蛋白(TNF-RFP)具有減少炎癥的作用，盡管其作用機制尚不清楚[113]。
NF-κB抑制劑
NF-κB在增強細胞對炎癥的反應中起著至關重要的作用。凝血酶不僅激活NF-κB，而且上調NF-κB依賴的基因[87]。由於細胞外組蛋白潛在地通過NF-κB途徑誘導內皮細胞上組織因子的表達，這放大了凝血酶的產生[149]。NF-κB抑制劑parthenolide在體外減少豬EC雕亡/死亡 26 。據報道，在免疫性腎小球腎炎中，小茴香內酯還可以減少內毒素休克和預防炎癥[150]。它被用作偏頭痛的預防性治療，並且據報道在臨床試驗中有益的效果[151]。
阿爾法1-心紅素(AAT)
AAT是壹種原型絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人類血液中含量豐富。雖然主要由肝細胞[152]產生，但也由其他細胞產生(例如，上皮細胞[153]，單核細胞[154]，巨噬細胞和中性粒細胞[155，156]，腸上皮細胞[157]，人胰島的α和δ細胞[158]，和癌細胞[159])。血漿AAT水平在炎癥和感染期間升高[160]。
AAT具有抗炎，抗白細胞遷移，抗雕亡和抗血栓形成的作用[161-166]。AAT治療顯著降低促炎細胞因子(IL-8，IL-1β，α)水平[115]。在同種異體胰島移植的猴子中，AAT防止了炎癥反應[167]，但當狒狒接受來自基因工程豬的動脈補片移植時，AAT治療對IL-8和C-RP水平沒有影響[13]。
血小板抑制劑
阿司匹林被廣泛用作預防血管疾病的藥物，並與心肌梗死和中風的減少有關[168]。此外，有證據表明阿司匹林下調某些促炎細胞因子(例如IL-6)[116]和前炎癥信號通路，包括NF-κB[16 9-171]。
三碘甲狀腺原氨酸(T3)
在豬異種移植物存在的情況下，尚不確定T3是否可以抑制炎癥狀態[79]，但T3治療減少了炎性細胞因子(如腫瘤壞死因子-α，IL-6)，改善了糖尿病大鼠的血糖控制[119]。然而，由於豬器官移植後所有狒狒的ft3水平都有所下降[30]，我們發現管理t3有助於提高ft3水平。
血紅素氧合酶-1(HO-1)的表達
HO-1已知具有抗炎作用和減少細胞雕亡[14，172-178]。它是壹種抗氧化酶，受紅系2相關因子2(Nrf2)途徑調節[194]。HO-1的激活可以通過上調NRF2/HO-1信號通路來防止腫瘤壞死因子-α誘導的炎癥和氧化損傷[195]。豬細胞上HHO-1的表達阻止腫瘤壞死因子α-和環己酰亞胺介導的雕亡(圖9)[圖9]，並導致粘附分子的下調，例如E-選擇素，ICAM-1和VCAM-1[175]。表達HHO-1的器官對大鼠異種心臟移植存活時間的延長至關重要[173，177]，豬胰島中表達HHO-1延長了小鼠的存活時間，並減少了免疫細胞浸潤和胰島細胞雕亡[178]。
A20的表達
A20，壹種腫瘤壞死因子-α誘導的蛋白，已被證明具有抗炎和抗雕亡作用[179-181]。A20是炎癥信號轉導的重要調節因子，可拮抗NF-κB的激活。幾個報告表明，A20在抑制NF-κB信號轉導中起著至關重要的作用，以響應α和微生物產物[180，181]。與野生型pAECs相比，來自hA20轉基因豬的pAECs雕亡明顯減少[179]。hA20轉基因豬心臟對缺血/再灌註損傷有部分保護作用[179]。
凝血調節蛋白的表達
幾種凝血調節蛋白具有抗炎特性，例如血栓調節蛋白[182-187]，內皮蛋白C受體(EPCR)[188]，胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(CD39)[189-191]和組織因子途徑抑制物(TFPI)[192，193]。據報道血栓調節蛋白的N-末端凝集素樣結構域具有直接的抗炎活性和抑制補體激活[182]。血栓調節蛋白還通過促進活化蛋白C[183-186]的產生而具有抗炎作用，活化蛋白C[183-186]具有抗凝活性，並具有直接的細胞保護作用[196]。內皮蛋白C受體也引起激活的蛋白C依賴和獨立的抗炎作用[188]。CD39是壹種主要的血管核苷二磷酸水解酶，可將三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)轉化為腺苷。CD39被證明通過抗炎腺苷受體信號通路保護移植腎免受缺血再灌註損傷[189]，並保護胰島免受即時血液介導的炎癥反應(IBMIR)[190]。TFPI是壹種基本的抗凝蛋白，它通過阻止凝血蛋白酶，因子VII至VIIa(FVIIa)和因子X至Xa(FXa)的激活起作用[197]。在小鼠肺炎球菌肺炎中，重組人TFPI可降低IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-γ、角質形成細胞源性細胞因子和巨噬細胞炎癥蛋白-2，並增加抗炎細胞因子IL-10[192]。
全身炎癥可能通過激活凝血級聯和免疫反應在豬器官異種移植中發揮重要作用。使用抗炎劑或通過引入人類炎癥調節轉基因對器官來源豬進行基因修飾，可能有助於預防或控制炎癥。控制炎癥可能會降低外源性免疫抑制治療的強度。如果要獲得異種移植物的免疫耐受，那麽炎癥的控制可能是必不可少的。