等電亮氨酸ph
關鍵詞：L-異亮氨酸；離子交換；提取；工藝條件
1前言
早在1936年，Rose等人根據動物營養試驗結果證實，L-異亮氨酸為人和動物體營養必需氨基酸之壹。它可作為強化劑添加於食品中，可用於配制壹般營養復合氨基酸輸液和治療型特種氨基酸輸液，其用量逐年增長IJl。目前，L-異亮氨酸主要是通過發酵法來生產，在L-異亮氨酸的發酵液中，除主要產物外還有其他氨基酸如丙氨酸、纈氨酸，因L-異亮氨酸跟這兩種氨基酸均為中性氨基酸，它們的結構相似，等電點也接近，導致L-異亮氨酸分離非常困難。目前中性氨基酸的工業化分離方法國內外報道都不多，為了提高總提取率，作者采用離子交換法對L-異亮氨酸的分離提取進行了研究。
2實驗部分
2．1 材料和儀器
001 X7(732)離子交換樹脂，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。離子交換柱(φ20×500mm)，無錫儀器廠。L-異亮氨酸發酵液，江南大學生物工程學院氨基酸研究室提供。回轉式恒溫調速搖瓶櫃HYG-II型，上海欣蕊自動化設備有限公司。PHs-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠。72 分光光度計，上海第三分析儀器廠。
2．2 發酵液預處理
在發酵液中加入草酸並加熱至80℃，保溫3min，離心除去部分菌體和碳酸鈣，上清液用絮凝劑處理，過濾，根據物質顏色與吸收光顏色的互補關系，實驗中采用650nm的入射波長，測定其透光率。
2-3 樹脂的預處理
陽離子交換樹脂依次用20％NaCl、2mol／LNaOH、2mol／L HCl浸泡洗滌，最後浸泡於去離子水中備用。
2．4 分析方法
L-異亮氨酸和L-丙氨酸含量的測定采用紙色譜定量分析法。即將待測液點樣於新華3號層析紙上，電吹風加熱趕氨，經展開劑(正丁醇：冰醋酸：水=4：l：1)展開後，用1.0％茚三酮丙酮溶液顯色，剪下斑點加5ml 75％乙醇：0.2％ CuSO4.5H20=39：l的溶液洗脫，顯色液在分光光度計的570nm波長下測吸光值，然後從標準曲線上查出氨基酸的含量。
2．5 靜態吸附量和選擇性系數的測定
準確量取經過預處理的lOml離子交換樹脂和100ml壹定濃度不同pH值的L-異亮氨酸發酵液，置於500ml的錐形瓶中。25"C下恒溫振蕩，直至平衡為止，測定平衡後發酵液中L－亮氨酸和L－丙氨酸的濃度，按(1)、(2)式計算樹脂的吸附量Q及選擇性系數KAB。Q=(Co-C‘)V／131.16W (1)式中，Co為起始發酵液中L-異亮氨酸的濃度(g／L)：C‘為平衡後發酵液中L-異亮氨酸的濃度(g／L),V為發酵液體積(L)； 為濕樹脂體積(L)：l31.16為L-異亮氨酸分子量；Q為樹脂交換容量(mol／L)。
2．6 動態吸附實驗
將壹定量的離子交換樹脂裝入玻璃交換柱中，通入已經預處理過的L-異亮氨酸發酵液，直至穿透液與茚三酮反應呈陽性為止，水洗後，用洗脫劑洗脫，分部收集流出液，確定最佳洗脫條件。
3結果和討論
3．1 發酵液預處理工藝的確定
發酵液是含有大量菌體等固形物組成復雜的帶有負電荷的膠體分散體系，同時具有親水性和憎水性的膠體特性。如果采用帶菌體的發酵液直接上柱，不僅給操作帶來困難，而且影響產品的質量和收率，因此采用絮凝沈降的辦法對發酵液進行預處理。殼聚糖是天然聚合物，具有無毒，易被動物消化吸收，對提高家禽的產蛋率和瘦肉率很有好處，用殼聚糖絮凝得到的菌體蛋白是很好的飼料添加劑。故本文采用殼聚糖為絮凝劑。以其處理後發酵液的透光率為考察指標，結果發現溶液pH和殼聚糖用量是影響絮凝效果的重要因素。
3．1．1 pH對絮凝效果的影響
溶液pH對絮凝作用的影響有兩方面：壹是影響菌體細胞表面帶電情況：二是影響絮凝劑的電離程度和絮凝劑分子鏈伸展程度。發酵液pH對絮凝效果的影響可以看出pH為2時，絮凝效果最好。這是因為殼聚糖作為壹線性含氨基的高分子氨基在酸性介質中質子化，表現出陽離子絮凝劑的性質。pH 值降低，殼聚糖陽離子絮凝劑的性質更加明顯，然而當溶液的pH值太低時，會使殼聚糖溶解，反而影響絮凝的效果，另外pH值還會影響殼聚糖的架橋能力，因此pH值太高或太低對絮凝都不利，應該把發酵液控制在合適的pH值。
3．1．2 殼聚糖用量對絮凝效果的影響
殼聚糖用量對絮凝效果的影響可以看出在壹定的pH值下，絮凝效果隨絮凝劑用量的增加而增加，達到峰值後，又隨絮凝劑用量的增加而降低，這與架橋絮凝機理壹致 l： 當高分子絮凝劑覆蓋微粒表面的部分接近50％時，其絮凝作用最佳； 當絮凝劑過量時，微粒表面全部被覆蓋，已沒有空余表面吸附起架橋作用的其他絮凝劑，又由於覆蓋的絮凝劑帶有許多親水官能團，故反而起分散作用，這時懸浮液又變為穩定的分散體系， 因此絮凝劑過量反而使絮凝效果下降。
3．2 pH值對樹脂交換容量和選擇性系數的影響
發酵液pH是影響交換平衡關系的壹個重要因素。通過靜態實驗，測定了不同pH下的離子交換容量可以看出pH為2時，樹脂的交換容量最大，為0.882mol／L。在pH 由6降至2的過程中L-異亮氨酸以陽離子形式存在，使陽離子交換樹脂的吸附量增加，但當pH繼續降低時，溶液中[H+]增加，與L-異亮氨酸根離子發生競爭吸附，因此導致交換容量降低。
3．3 發酵液中L-異亮氨酸濃度對樹脂交換容量的影響
配制不同濃度的L-異亮氨酸溶液，在pH為2的條件下測定樹脂的靜態交換容量，實驗結果可以看出，隨溶液中L-異亮氨酸濃度增加，樹脂的交換容量增加，但在濃度大於0.16mol／L以後增加L-異亮氨酸濃度對交換容量的提高影響不大。
3．4 固定床操作工藝
上柱：經預處理後的發酵液調酸至pH為2上柱。另外固定床操作的壹個重要參數是固液兩相的接觸時間，可以用BV／h表示，即每小時流經柱子的上樣液為床體積BV（Bed Volume）的倍數。為了進行有效的交換，離子交換過程中必須使固液兩相有充分的接觸時間，如果液相流速增加，固液接觸時間縮短，樹脂與上樣液來不及交換，就會導致交換區拉長，很快發生滲漏現象。通過實驗上柱流速采用0.6BV/h。
水洗： 上柱後， 用適量的水洗。壹般為上柱發酵液體積的l～2倍，水洗流速為1.0BV／h。
洗脫：本實驗以O.1mol／L，0.2mol／L，O.5mol／L，lmol／L的氨水和0.2mol／L，O.5mol／L，O.8mol／L，1mol／L的NH4Cl作為洗脫劑進行洗脫。結果發現以氨水洗脫時，L-異亮氨酸與L-丙氨酸重疊較多，而以O.5mol／L的NH4Cl作為洗脫劑時，分離效果較好。
3．5 洗脫液的脫色與精制
本實驗采用粉末狀活性炭脫色。活性炭脫色是利用優先選擇吸附有機大分子色素的特性，將色素分子強烈吸附於活性炭顆粒表面，隨活性炭的分離而被除去。據文獻報道，在偏酸性條件下活性炭脫色效果顯著。因此本實驗選定pH為4.5。並且通過多次實驗，發現當活性炭用量為l％、溫度為8O℃脫色lh，能達到較理想的脫色效果。
脫色液經旋轉蒸發儀濃縮，加入乙醇結晶，於4℃靜置過夜，過濾晶體，真空幹燥12h，即得成品。成品總提取率為55％，高氯酸滴定法測得其純度達98.8％ 。
4結 論
1．殼聚糖對L-異亮氨酸發酵液中的菌體具有良好的絮凝作用。溶液pH和殼聚糖用量是影響絮凝效果的重要因素。pH為2，殼聚糖用量為30mg／L時可獲得良好的絮凝效果。
2．pH 2時最有利於732樹脂吸附L-異亮氨酸。增加溶液中L-異亮氨酸濃度有利於增加樹脂吸附量，但當L-異亮氨酸濃度大於O.16mol／L時，這種影響不明顯。
3．L．異亮氨酸經732 樹脂吸附，0.5mol／L NH4Cl洗脫後濃縮結晶得成品，成品總提取收率為55％。