常用蛋白質沈澱方法有哪些?有哪些應用實例?求答案
蛋白質變性是指光照,熱,有機溶濟以及壹些變性劑(如重金屬鹽)的作用時蛋白質的空間結構被破壞,使得蛋白質喪失活性,該過程不可逆。
鹽析是指向蛋白質的溶液中加入輕金屬鹽,使得蛋白質沈澱析出,這是由於加入鹽降低了蛋白質得溶解度而析出,該過程可逆,加水蛋白質又會溶解。
(壹)材料的預處理及細胞破碎
分離提純某壹種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:
1. 機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
3. 反復凍融法
生物組織經凍結後,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要註意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。
4. 超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
(二) 蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中壹般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結構破壞,利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中,應註意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性。
(三)蛋白質粗制品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法:
1. 等電點沈澱法
不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沈澱法使它們相互分離。
2. 鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沈澱析出。被鹽析沈澱下來的蛋白質仍保持其天然性質,並能再度溶解而不變性。
3. 有機溶劑沈澱法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沈澱出來,因此可用來沈澱蛋白質。此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要註意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度。
(四)樣品的進壹步分離純化
用等電點沈澱法、鹽析法所得到的蛋白質壹般含有其他蛋白質雜質,須進壹步分離提純才能得到有壹定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。